ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

1. ציפוי H-RPE בצלחת תרבית התא הפשירו H-RPE בבקבוק T25 במדיום RPE אנושי בתוספת תוספי RPE בינוניים (4 מ”מ L-גלוטמין, 25 נ”ג/מ”ל FGF-2, 2% FBS, 30 מ”ג/מ”ל גנטמיצין ו-15 מיקרוגרם/מ”ל אמפוטריצין). לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2 באינקובטור לח. רעננו את המדיה למחרת והמתינו עד שהתאים יגיעו למפגש של 80% לפחות לפני המעבר ביחס של 1:3 לצלוחית T75. לאחר המפגש, עברו את התאים באמצעות ערכת ריאגנטים תת-תרבית המורכבת מתמיסת טריפסין/EDTA 0.025%, תמיסת נטרול טריפסין ותמיסת מלח חוצצת HEPES (pH 7.0-7.6).יש לשטוף את H-RPE בעדינות עם 3 מ”ל של מלח חוצץ HEPES. לאחר מכן יש להוסיף 3 מ”ל טריפסין/EDTA ולדגור (37°C ו-5% CO2) למשך 5 דקות (או עד שהתאים התרוממו מבסיס הצלוחית, כפי שנצפה במיקרוסקופ). נטרול טריפסין/EDTA עם 3 מ”ל של תמיסת נטרול טריפסין. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 3.5 דקות כדי ליצור את גלולת התא. בזהירות לשאוף ולהשליך את supernatant. להשהות מחדש את התאים בתווך RPE אנושי לריכוז סופי של 20,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר לבאר.פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי להבטיח שתרחיף התא הומוגני, תוך שימוש בפיפטה רב-ערוצית לקלות ועקביות של פיפטינג לתוך מיקרו-צלחת תרבית תאים בת 96 בארות. הניחו את קצה הפיפטה ממש מתחת לשפה העגולה בחלק העליון של הבאר לקבלת שכבת תאים אחידה והומוגנית.הערה: אין צורך בציפוי מכיוון שהתאים נצמדים היטב למיקרו-לוחית. הקפידו להשאיר את ארבע הבארות הפינתיות ריקות מתאים (100 מיקרוליטר של מדיה בלבד) כדי שישמשו כבארות תיקון רקע (איור 1A).הערה: צלחת המיקרו מעוצבת בעיצוב לוח טיפוסי של 96 בארות; עם זאת, שטח הפנים של כל באר הוא 0.106 ס”מ2, שהוא 40% קטן יותר מאשר צלחת סטנדרטית 96 בארות. בצפיפות תאים זו, התאים צריכים להיות 100% במפגש למחרת. מומלץ לבצע ניסוי אופטימיזציה של צפיפות התאים תחילה לפני בדיקת טיפולים כדי להבטיח שקריאות OCR ו- ECAR בסיסיות הן סביב 50-100 pmol / min ו- 10-20 mpH / min, בהתאמה. השאירו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת לפני שתחזירו אותה לאינקובטור (5% CO2, 37°C, לח) כדי לסייע במזעור השפעות הקצה. השפעות קצה הן שינויים בנפח המדיה בבארות של הגבולות ההיקפיים של צלחת 96 בארות עקב אידוי14.הערה: התאים ידבקו במהלך הלילה וייצרו חד-שכבה מתלכדת למחרת. H-RPE מבשילים בצלחת לפחות חודש אחד על ידי רענון מחצית ממצע הגידול כל 2-3 ימים. בחנו את התאים מתחת למיקרוסקופ לפני שינוי המדיה כדי לבדוק את המורפולוגיה ואת רמת הפיגמנטציה שלהם. ודא שהתאים נמצאים במפגש עם מורפולוגיה אופיינית דמוית אבן מרוצפת ורוכשים פיגמנטציה לאורך זמן, כפי שניתן לראות בתמונות המורפולוגיה ב- Shu et al.7. 2. יום לפני ביצוע הבדיקה ודא כי מחסנית החיישן הוא hydrated יום לפני הבדיקה על ידי מילוי כל באר של צלחת השירות עם 200 μL של מים deionized.הערה: מכסה צלחת השירות מכיל ביו-חיישנים פלואורסצנטיים למדידת רמות חמצן ו- pH עבור כל באר. החיישנים מחוברים למדריכי גל סיבים אופטיים המעבירים אור באורכי גל עירור שונים ומעבירים אות פלואורסצנטי דרך מסננים אופטיים לגלאי אור. הניחו את מחסנית החיישן השקועה במים בלוח השירות יחד עם ~20 מ”ל של הכיול (כדי להתחמם לשימוש למחרת) בתנור לחות של 37°C (ללא CO2) למשך הלילה.הערה: הכיול הוא פתרון קנייני המיועד לכיול מחסניות חיישנים וככל הנראה דומה בהרכבו למלח חוצץ פוספט (PBS). הזמן המינימלי להידרציה של מחסנית הוא 4 שעות, אך התוצאות הטובות ביותר מתקבלות עם הידרציה בלילה. ודא שהמכשיר מופעל והפעל את התוכנה כדי לאפשר למכשיר להתייצב ל-37°C במהלך הלילה (איור 2). בדרך כלל, ניתן להשאיר את המכשיר דולק גם כאשר אינו בשימוש. 3. מבחן מאמץ מיטו בזמן אמת באמצעות מנתח שטף חוץ תאי ביום הבדיקה, החלף את המים בלוחית השירות בנפח שווה של קליבר מחומם לפחות 45 דקות לפני הפעלת הבדיקה. הפוך את מדיית בדיקת המאמץ של מיטו באמצעות מדיום הבסיס ללא פנול אדום על ידי הוספת תוספים, כפי שמוצג בטבלה 1. חממו את המדיה ל-37°C, התאימו את ה-pH ל-7.4 וסננו את המדיה באמצעות יחידת סינון עליונה של הצינור. עבור הפעלת צלחת מלאה, לעשות ~ 25 מ”ל של מדיה assay. הסר את מדיית RPE האנושית והחלף אותה ב- 180 μL של מדיית בדיקה טרייה שהוכנה (שלב 3.2). מניחים את צלחת תרבית התאים בתנור לחות 37 מעלות צלזיוס (ללא CO2) למשך שעה אחת לפני תחילת הבדיקה.הערה: זה חשוב לפירוק גזים של צלחת התא, ומאפשר דיפוזיה שלCO2 . מכיוון שהתאים כבר לא נמצאים במצע הגידול שלהם וכבר לא באינקובטור עםCO2, הכדאיות שלהם תדרדר עם הזמן, ולכן יש להקפיד לבצע את הבדיקה בצורה יעילה ככל האפשר. כמו כן, יש להקפיד על כך שאין בועות בצלחת תרבית התא; אם יש כאלה, פוצצו אותם עם פיפטה או מחט. לכל מחסנית חיישן יש ארבע יציאות משלוח ריאגנטים לכל באר להזרקת תרכובות בדיקה לבארות של צלחת תרבית התאים במהלך הבדיקה (איור 1C,D). הכינו ~3 מ”ל של תמיסות התרופות פי 10 על ידי דילול מלאי התרופות במדיית הבדיקה המתאימה לפי טבלה 2. לדוגמה, טען את פורט A עם 25 מיקרומטר של אוליגומיצין מומס במדיית בדיקת המאמץ של מיטו, כך שכאשר נפח התרופה מוזרק לבאר על ידי המכשיר, הריכוז הסופי שכל תא נחשף אליו הוא 2.5 מיקרומטר. פיפטה 20 מיקרוליטר של מלאי התרופות פי 10 לפורט A, 22 מיקרוליטר לפורט B, ו-25 μL לתוך פורט C, כדי להשיג את ריכוז התרופה הסופי שצוין בכל באר. עבור פרוטוקולים המחייבים את כל ארבע יציאות התרופות, פיפטה 28 μL לתוך פורט D.הערה: עיין באיור 1B בעת החדרת התרופות לתוך יציאות הסמים כדי לראות את ההתמצאות הנכונה של יציאות A/B/C/D. החריץ בקצה המחסנית צריך להיות ממוקם בפינה השמאלית התחתונה בעת טעינת יציאות הסמים. על ידי זינוק בזווית לתוך כל יציאת סמים, ניתן למזער בועות. אם יש בועות קיימות, יש להקפיד לפוצץ אותן עם פיפטה או מחט. פתח את הכרטיסיה תבניות בתוכנת הניתוח, בחר מבחן מאמץ מיטו ומלא את הגדרות הקבוצה.פרטי קלט על אסטרטגיית ההזרקה (במקרה זה, היא מוזנת מראש כתרופות מבחן הלחץ של מיטו). הזן פרטים לגבי קבוצות הניסוי השונות בבדיקה (למשל, בקרה או טיפול). הזן פרטים על מדיית ה- Assay ( הוספת תוספים שונים וריכוזיהם הספציפיים למדיית הבדיקה הבסיסית) ולבסוף הוסף את סוג התא. לחץ על הכרטיסייה הבאה, מפת לוחות, שבה הקבוצות השונות הנבחנות ישובצו למיקומן הספציפי במפת לוחות 96 הקידוחים. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה פרוטוקול כדי לסקור את פרוטוקול המכשיר עבור פרוטוקול ברירת המחדל של מבחן המאמץ Mito .הערה: תבנית ברירת המחדל Mito Stress Test מוכנה לשימוש, אך ניתן לשנות אותה בכל דרך כדי להתאים לעיצוב הניסוי. לדוגמה, זמן המדידה המוגדר כברירת מחדל הוא 3 דקות, אך ניתן לשנות אותו ל- 5 דקות אם תרצה בכך. לחץ על הפעל את הבדיקה והכנס את מחסנית החיישן השקועה בתמיסת הכיול בלוח השירות. תהליך זה אורך כ-25 דקות. בשלב זה, כל ביו-חיישן מכויל באופן עצמאי בהתבסס על תפוקת החיישן הנמדדת בתמיסה המכוילת של pH ידוע וריכוז חמצן.לאחר כיול, הסר את צלחת השירות והכנס את צלחת תרבית התא.הערה: לוחית תרבית התאים מאוזנת תחילה, ולאחר מכן, המכשיר מתחיל לערבב את מדיית הבדיקה ולמדוד את ערכי OCR ו- ECAR. שלב זה אורך כשעה וחצי ומתבצע בתוך המכשיר ללא כל התערבות מצד המשתמש. קריאה בסיסית של OCR ו- ECAR נוצרת תחילה על ידי ערבוב מדיית הבדיקה למשך 3 דקות ולאחר מכן מדידת OCR ו- ECAR למשך 3 דקות. הכלי מבצע שלוש לולאות של ערבוב ומדידה. לאחר המדידה הבסיסית, המכשיר מזריק באופן אוטומטי את תמיסת התרופה Port A לכל באר. לאחר מכן מופיעות שלוש לולאות של ערבוב ומדידה (3 דקות כל אחת). אותו דפוס מתרחש לאחר כל הזרקת תרופה עוקבת (יציאות B ו-C). לאחר השלמת ההפעלה, הסר את לוחית תרבית התאים ואת מחסנית החיישן. למטרות בקרת איכות, ודא שכל יציאות התרופות במחסנית החיישן הוזרקו על ידי בדיקת היציאות כדי לבדוק שלא נותרה תרופה שיורית. יש להשליך את מחסנית החיישן ואת לוחית השירות מכיוון שהם פריטים לשימוש חד-פעמי. בחנו את התאים במיקרו-צלחת של תרבית התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שעדיין קיימת שכבה חד-שכבתית של תאים. השליכו את מדיית הבדיקה והחליפו אותה ב-60 μL של חיץ ליזה 1x בכל באר.הערה: חיץ הליזיס עשוי ממאגר ליזיס 10x מדולל ל-1x במים נטולי יונים, בתוספת של 1 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF). עטפו את שולי הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי והכניסו אותה למקפיא בטמפרטורה של -80°C כדי לסייע בליזה של התא למשך הלילה, לפני כימות תכולת החלבון באמצעות בדיקת BCA. לניתוח נתונים, נרמל את כל הנתונים על ידי חלוקת ערכי OCR ו- ECAR במיקרוגרם של חלבון בכל באר. יצא את מחולל הדוחות Mito Stress Test, המשתמש בפקודות מאקרו של Excel כדי לחשב באופן אוטומטי את הפרמטרים של Mito Stress Test באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.הערה: ניתן להשתמש בו כדי לקבוע נשימה בסיסית, נשימה מרבית, יכולת נשימה רזרבי, דליפת פרוטונים, ייצור ATP ונשימה שאינה מיטוכונדריאלית. ההגדרות של חישובים אלה מפורטות בטבלה 3. 4. בדיקת מאמץ גליקוליטי בזמן אמת באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי בצע את מבחן המאמץ הגליקוליטי על-ידי ביצוע אותם שלבים כמו מבחן המאמץ של מיטו, למעט שימוש בתוספי המדיה השונים של הבדיקה ובזריקות התרופות המוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2. לצורך ניתוח נתונים, יצא את מחולל הדוחות של בדיקת מאמץ גליקוליטית, המשתמש בפקודות מאקרו של Excel כדי לחשב באופן אוטומטי את הפרמטרים של בדיקת מאמץ גליקוליטית מתוכנת ניתוח הנתונים.הערה: ניתן להשתמש בו כדי לקבוע החמצה לא גליקוליטית, גליקוליזה, קיבולת גליקוליטית ועתודה גליקוליטית. ההגדרות של חישובים אלה מפורטות בטבלה 3. 5. בדיקת כימות חלבון BCA הערה: בדיקת כימות החלבון של חומצה דו-כיוונית (BCA) (ידועה גם בשם מבחן סמית15) היא בדיקה קולורימטרית מבוססת נחושת המשמשת לקביעת תכולת החלבון הכוללת בדגימה. נרמול נתוני OCR ו-ECAR למיקרוגרם של חלבון בכל באר מבטיח שכמויות שונות של תאים/חלבון בכל באר לא יטו את הקריאות. המנגנון של בדיקת BCA מבוסס על שתי תגובות כימיות. ראשית, הקשרים הפפטידים בחלבונים מפחיתים יונים קופריקליים (Cu2+) ליונים קופרוסים (Cu+), שהיא תגובה תלוית טמפרטורה הנעזרת בטמפרטורות גבוהות יותר (37 עד 60 מעלות צלזיוס). אם יש יותר קשרים פפטידיים, מה שהופך את כמות Cu2+ פרופורציונלית לתכולת החלבון בתמיסה16. תגובה זו גורמת לשינוי צבע מירוק לתמיסה סגולה עזה, עם ספיגת שיא של 562 ננומטר16. ככל שתכולת החלבון בדגימה גבוהה יותר, כך הספיגה באורך גל זה גבוהה יותר. טווח העבודה של ערכה זו הוא 20-2,000 מיקרוגרם/מ”ל. ערכת בדיקת BCA מכילה 1 מ”ל aliquots של אלבומין בסרום בקר (BSA) ב 2 מ”ג / מ”ל, המשמש תקן ייחוס ריכוז חלבון. הכינו דילול סדרתי בצלחת שקופה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות על ידי התחלה מ-BSA לא מדולל של 2 מ”ג/מ”ל ולאחר מכן הפחתת הריכוז בחצי על ידי דילול במים שעברו דה-יוניזציה (למשל, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 מ”ג/מ”ל וכו’). שימוש בריכוז ידוע של חלבון מאפשר חישוב של עקומה סטנדרטית, המשמשת לחישוב תכולת החלבון של דגימות הניסוי. כדי לשפר את הדיוק של מדידות תכולת החלבון המחושבות, מדדו את קריאות הספיגה של תקני הייחוס של ריכוז החלבונים לצד דגימות הניסוי עבור כל בדיקה. פיפטה 25 μL של כל דילול סדרתי BSA בשכפול לתוך צלחת 96 באר. פיפטה 25 μL של חיץ ליזיס 1x בשכפול לתוך צלחת 96 באר לשמש ריק. הפשירו את צלחת תרבית התא לטמפרטורת החדר ואת פיפטה 25 μL של כל תא ליזט בשכפול לתוך צלחת 96 בארות. הכינו את מגיב העבודה ביחס של 50:1 של ריאגנטים של ערכת BCA A:B. ערבבו היטב על ידי מערבולות כדי להסיר כל עכירות בריאגנטים העובדים, כך שמדובר בתמיסה ירוקה הומוגנית. הוסף 200 μL של מגיב עובד לכל באר. הגנו על הצלחת מפני אור על ידי כיסוי הצלחת בנייר כסף ודגרו בתנור של 18 מעלות למשך 20 דקות. מדוד את הספיגה ב- 562 ננומטר בקורא לוחות של 96 בארות. לצורך ניתוח נתונים, בצע ממוצע של כל הערכים הכפולים. הפחת את רמות הספיגה הריקות שנקבעו מבארות החיץ של ליזיס 1x מהמדידות של כל הדגימות. קבע את עקומת התקן על ידי התוויית הספיגה של כל תקן BSA לריכוז הידוע שלו במק”ג/מ”ל. השתמש במשוואה הליניארית הנגזרת מהעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז החלבונים של דגימות הניסוי.