使用高分辨率呼吸测定法实时分析原代人视网膜色素上皮细胞中的生物能量学

1. 在细胞培养板中接种H-RPE 在补充有 RPE 生长培养基补充剂（4 mM L-谷氨酰胺、25 ng/mL FGF-2、2% FBS、30 mg/mL 庆大霉素和 15 μg/mL 两性霉素）的人 RPE 培养基中的 T25 烧瓶中解冻 H-RPE。 在加湿的培养箱中将细胞在37°C和5%CO2 下孵育。第二天刷新培养基，等待细胞达到至少80%汇合，然后以1：3的比例传代到T75烧瓶中。 汇合后，使用由胰蛋白酶/ EDTA 0.025%溶液，胰蛋白酶中和溶液和HEPES缓冲盐水（pH 7.0-7.6）组成的传代培养试剂盒传代细胞。用 3 mL HEPES 缓冲盐水轻轻冲洗 H-RPE。然后加入3mL胰蛋白酶/ EDTA并孵育（37°C和5%CO2）5分钟（或直到细胞从烧瓶底部抬起，如在显微镜下观察到的那样）。用 3 mL 胰蛋白酶中和溶液中和胰蛋白酶/EDTA。 将细胞以200× g 离心3.5分钟以形成细胞沉淀。小心吸出并丢弃上清液。 将细胞重悬于人RPE培养基中，终浓度为每孔每100μL20，000个细胞。多次上下移液以确保细胞悬液均匀，使用多通道移液器轻松一致地移液到 96 孔细胞培养微孔板中。将移液器吸头放在孔顶部的圆形边缘下方，以获得均匀、均匀的细胞层。注意：由于细胞很好地粘附在微孔板上，因此不需要涂层。 确保将四个角孔留空细胞（仅 100 μL 培养基）以用作背景校正孔（图 1A）。注意：微孔板采用典型的96孔板设计;然而，每个孔的表面积为0.106cm2，比标准的96孔板小40%。在此细胞密度下，细胞应在第二天100%汇合。建议在测试处理之前先进行细胞密度优化实验，以确保基础OCR和ECAR读数分别约为50-100 pmol/min和10-20 mpH/min。 将细胞培养板在室温（RT）下放置1小时，然后将其放回培养箱（5%CO2，37°C，加湿），以帮助最大程度地减少边缘效应。边缘效应是由于蒸发14引起的96孔板外围边界孔中培养基体积的变化。注意：细胞将粘附过夜，并在第二天形成汇合的单层。H-RPE通过每2-3天刷新一半的生长培养基在平板中成熟至少1个月。 在更换培养基之前，在显微镜下检查细胞以检查其形态和色素沉着水平。确保细胞与特征性的鹅卵石状形态汇合，并随着时间的推移获得色素沉着，如Shu等人的形态图像所示7。 2. 运行检测的前一天 通过在实用板的每个孔中填充 200 μL 去离子水，确保在测定前一天对传感器盒进行水合。注意：实用板的盖子包含荧光生物传感器，用于测量每个孔的氧气和pH值。传感器耦合到光纤波导，光纤波导以各种激发波长传输光，并通过滤光片将荧光信号传输到光电探测器。 将传感器盒浸没在实用板中的水中，连同~20 mL校准品（预热以第二天使用）一起放入37°C加湿炉（不含CO2）中过夜。注意：校准器是专为传感器盒校准而设计的专有解决方案，其成分可能与磷酸盐缓冲盐水（PBS）相似。墨盒水合的最短时间为4小时，但过夜水合获得最佳结果。 确保仪器已打开并启动软件，以使仪器在过夜之间稳定至37°C（图2）。通常，即使不使用，仪器也可以保持打开状态。 3. 使用细胞外通量分析仪进行实时Mito压力测试 在测定当天，在运行测定前至少45分钟用等体积的加热校准剂替换实用板中的水。 通过添加添加剂，使用不含酚红的基础培养基制作Mito压力测试测定培养基，如 表1所示。将培养基加热至37°C，将pH调节至7.4，并使用管顶过滤装置对培养基进行真空过滤。对于运行整个板，制作~25 mL测定培养基。 取出人RPE培养基并用180μL新鲜制备的测定培养基代替（步骤3.2）。在开始测定之前，将细胞培养板置于加湿的37°C烘箱（无CO2）中1小时。注意：这对于对细胞板进行脱气很重要，允许CO2 扩散。由于细胞不再在其生长培养基中，也不再在装有CO2的培养箱中，因此它们的活力会随着时间的推移而恶化，因此，应注意尽可能有效地进行测定。还应注意确保细胞培养板中没有气泡;如果有，请用移液管或针头弹出它们。 每个传感器盒每个孔有四个试剂输送端口，用于在测定过程中将测试化合物注入细胞培养板的孔中（图1C，D）。根据 表2稀释相应测定培养基中的药物储备液，制备~3mL的10x药物溶液。例如，用溶解在Mito压力测试测定培养基中的25μM寡霉素加载端口A，使得当药物体积通过仪器注入孔中时，每个细胞暴露于的最终浓度为2.5μM。 将 20 μL 的 10x 药物原液移液到端口 A 中， 22 μL 移液到端口 B 中， 并将 25 μL 放入端口 C，以达到每个孔中指定的最终药物浓度。对于需要所有四个药物端口的方案，将 28 μL 移液到端口 D 中。注意：将药物移液到药物端口时，请参阅 图1B ，以了解端口A/B/C/D的正确方向。装载药物端口时，墨盒边缘的凹口应位于左下角。通过以一定角度移液进入每个药物端口，可以最大限度地减少气泡。如果存在任何气泡，应小心用移液管或针头弹出它们。 在分析软件中打开 模板 选项卡，选择 Mito压力测试，然后填写 组定义。输入有关 注射策略 的详细信息（在这种情况下，它被预先输入为Mito压力测试药物）。输入有关测定中不同实验组的详细信息（例如， 对照或处理）。输入检测培养基的详细信息（将不同的添加剂及其特定浓度添加到基础 检测培养基 中），最后添加 细胞类型。 单击下一个选项卡，板图，其中被检查的不同组将被分配到其在96孔板 图上的特定位置。完成此操作后，单击 “协议 ”选项卡以查看默认 Mito 压力测试 协议的仪器协议。注意：默认的 Mito 压力测试 模板已准备就绪，但可以以任何方式修改以适应实验设计。例如，默认测量时间为 3 分钟，但如果需要，可以将其修改为 5 分钟。 单击运行 检测 并将浸没在校准溶液中的传感器盒插入实用板。此过程大约需要 25 分钟。在此步骤中，每个生物传感器根据已知pH和氧气浓度的校准溶液中测量的传感器输出进行独立校准。校准后，取出实用板并插入细胞培养板。注意：首先平衡细胞培养板，然后仪器开始混合测定培养基并测量OCR和ECAR值。此步骤大约需要 1.5 小时，并在仪器内进行，无需用户的任何干预。首先通过混合测定培养基3分钟，然后测量OCR和ECAR3分钟来建立OCR和ECAR的基线读数。该仪器执行三个混合和测量循环。 基线测量后，仪器自动将端口A药物溶液注入每个孔中。接下来是三个混合和测量循环（每个3分钟）。每次后续药物注射（端口B和C）后都会发生相同的模式。 运行完成后，取出细胞培养板和传感器盒。出于质量控制目的，通过检查端口以检查没有残留药物，确保传感器盒中的所有药物端口都已注射。丢弃传感器盒和实用板，因为它们是一次性物品。 在显微镜下检查细胞培养微孔板中的细胞，以确保仍然存在汇合的单层细胞。丢弃测定培养基，并在每个孔中用 60 μL 1x 裂解缓冲液替换。注意：裂解缓冲液由10倍裂解缓冲液制成，在去离子水中稀释至1倍，并加入1mM苯基甲基磺酰氟（PMSF）。 在使用BCA测定定量蛋白质含量之前，将板的边缘包裹在石蜡膜中以防止蒸发，并将其放入-80°C冰箱中以帮助细胞裂解过夜。 对于数据分析，通过将 OCR 和 ECAR 值除以每个孔中的蛋白质微克来标准化所有数据。导出 Mito 压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏使用数据分析软件自动计算 Mito 压力测试参数。注意：这可用于确定基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力、质子泄漏、ATP 产生和非线粒体呼吸。 表 3 列出了这些计算的定义。 4. 使用细胞外通量分析仪进行实时糖酵解应激测试 按照与Mito压力测试相同的步骤进行糖酵解应激测试，除了使用表 1 和 表2所示的不同测定培养基补充剂和药物注射剂。 对于数据分析，请导出糖酵解压力测试报告生成器，该生成器利用 Excel 宏从数据分析软件自动计算糖酵解压力测试参数。注意：这可用于确定非糖酵解酸化、糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。 表 3 列出了这些计算的定义。 5. 支链氨基酸定量测定 注意：二辛可酸（BCA）蛋白质定量测定（也称为史密斯测定15）是一种基于铜的比色测定，用于确定样品中的总蛋白质含量。将OCR和ECAR数据标准化为每个孔中的微克蛋白质可确保每个孔中不同数量的细胞/蛋白质不会扭曲读数。BCA测定的机理基于两种化学反应。首先，蛋白质中的肽键将铜离子（Cu2+）还原为亚铜离子（Cu+），这是一种由较高温度（37至60°C）辅助的温度依赖性反应。如果有更多的肽键，则使Cu2+的量与溶液中的蛋白质含量成正比16。该反应导致颜色从绿色变为浓紫色溶液，在562nm16处具有峰吸光度。样品中的蛋白质含量越高，该波长下的吸光度就越高。该试剂盒的工作范围为 20-2，000 μg/mL。 BCA 检测试剂盒含有 1 mL 等分试样的 2 mg/mL 牛血清白蛋白 （BSA），可作为蛋白质浓度参考标准品。从未稀释的 2 mg/mL BSA 开始，在透明的平底 96 孔板中制备连续稀释液，随后通过在去离子水中稀释（例如，2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL 等）将浓度减半。使用已知浓度的蛋白质可以计算标准曲线，该曲线用于计算实验样品的蛋白质含量。为了提高计算的蛋白质含量测量的准确性，请在每次测定的实验样品旁边测量蛋白质浓度参考标准品的吸光度读数。 将 25 μL 的每种 BSA 系列稀释液一式两份移液到 96 孔板中。 将 25 μL 的 1x 裂解缓冲液一式两份移液到 96 孔板中作为空白。 将细胞培养板解冻至室温，并将 25 μL 的每种细胞裂解物一式两份移液到 96 孔板中。 以 50：1 比例的 BCA 试剂盒试剂 A：B 制备工作试剂.通过涡旋充分混合以去除工作试剂中的任何浊度，使其成为均匀的绿色溶液。向每个孔中加入 200 μL 工作试剂。 通过将板盖在箔纸中来保护板免受光照，并在37°C烤箱中孵育20分钟。 在96孔板读数器中测量562nm处的吸光度。 对于数据分析，对所有重复值求平均值。从所有样品的测量中减去从1x裂解缓冲液孔中确定的空白吸光度水平。通过将每种BSA标准品的吸光度绘制为其已知浓度（以μg/mL为单位）来确定标准曲线。使用从标准曲线推导出的线性方程来确定实验样品的蛋白质浓度。