JoVE Journal > Immunology and Infection
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면역학 및 감염병학

Metodi di coltivazione delle spirochete di Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex e febbre recidivante Borrelia

Published: November 25, 2022
doi:
10.3791/64431
, , , , , ,
1Department of Biology,Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology,Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences,Institute of Parasitology

Summary

La coltura in vitro è un metodo di rilevamento diretto per la presenza di batteri viventi. Questo protocollo descrive i metodi per la coltura di diverse spirochete Borrelia, comprese quelle del complesso Borrelia burgdorferi sensu lato, della febbre recidivante delle specie Borrelia e della Borrelia miyamotoi. Queste specie sono esigenti e a crescita lenta, ma possono essere coltivate.

Abstract

La Borrelia è costituita da tre gruppi di specie, quelle del gruppo Borreliosi di Lyme (LB), noto anche come B. burgdorferi sensu lato (s.l.) e recentemente riclassificato in Borreliella, il gruppo della febbre recidivante (RF) Borrelia e un terzo gruppo di spirochete associate ai rettili. I metodi basati sulla coltura rimangono il gold standard per il rilevamento in laboratorio di infezioni batteriche sia per la ricerca che per il lavoro clinico, poiché la coltura di agenti patogeni da fluidi corporei o tessuti rileva direttamente agenti patogeni replicanti e fornisce materiale di partenza per la ricerca. Le spirochete Borrelia e Borreliella sono fastidiose e a crescita lenta, e quindi non sono comunemente coltivate per scopi clinici; Tuttavia, la cultura è necessaria per la ricerca. Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare con successo spirochete LB e RF, comprese tutte le specie riconosciute del complesso B. burgdorferi s.l. tra cui B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis espirochete RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis e B. miyamotoi. Il terreno di base per la coltivazione di spirochete LB e RF è il mezzo Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), che supporta in modo affidabile la crescita delle spirochete nelle culture consolidate. Per essere in grado di coltivare isolati di Borrelia appena isolati da campioni derivati da zecche o ospiti in cui il numero iniziale di spirochete è basso nell’inoculo, è preferibile il mezzo Kelly-Pettenkofer (MKP) modificato. Questo mezzo supporta anche la crescita di B. miyamotoi. Il successo della coltivazione delle spirochete RF dipende anche in modo critico dalla qualità degli ingredienti.

Introduction

Borrelia è un genere di batteri spirocheta che comprende tre cladi principali: il gruppo della borreliosi di Lyme (LB), il gruppo della febbre recidivante (RF) e un gruppo meno ben caratterizzato apparentemente limitato ai rettili. La tassonomia di Borrelia è in continua evoluzione con l’avvento di metodologie molecolari che consentono confronti tra genoma e proteoma, come è vero per la maggior parte degli altri gruppi tassonomici 1,2,3,4,5,6,7. Il gruppo LB (chiamato anche gruppo della malattia di Lyme) è stato tradizionalmente definito Borrelia burgdorferi sensu lato dopo il suo membro meglio caratterizzato Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Questo articolo utilizza la terminologia attualmente più diffusa: LB, RF e gruppo associato ai rettili e descrive i protocolli di coltura per i gruppi LB e RF.

Come ci si aspetterebbe per un membro della famiglia delle Spirochaetaceae, Borrelia può adottare la caratteristica forma a spirale lunga e sottile, tipicamente lunga 20-30 μm e larga 0,2-0,3 μm. Tuttavia, le cellule di Borrelia sono altamente pleomorfe e possono assumere molte altre forme sia in coltura che in vivo 1,8 come risultato della loro complessa struttura cellulare e genetica. Nella sua forma spirochetale, la morfologia dell’onda sinusoidale planare risulta dai suoi endoflagelli assiali che ruotano nello spazio periplasmatico tra le membrane interne ed esterne. Questa struttura consente alle cellule di essere altamente mobili, con la membrana esterna contenente proteine che consentono alla cellula di interagire con i tessuti ospiti 9,10. L’espressione delle proteine della membrana esterna è strettamente regolata e influenza non solo l’invasione del tessuto ospite, ma anche l’interazione con il sistema immunitario dell’ospite11. Questa complessa espressione genica consente alle cellule Borrelia di fare la spola tra ambienti molto diversi di ospiti vertebrati e vettori invertebrati. Il genoma di Borrelia è insolito tra i procarioti, costituito da un cromosoma lineare piuttosto che circolare. Oltre al cromosoma lineare, le specie Borrelia contengono 7-21 plasmidi, alcuni lineari e alcuni circolari. I plasmidi ospitano la maggior parte dei geni necessari per l’adattamento e la virulenza dell’ospite, e si ritiene che i plasmidi circolari derivati dai profagi siano responsabili della maggior parte del flusso genico orizzontale tra le cellule spirochetali12,13. Coerentemente con un ruolo nell’adattamento dell’ospite, alcuni, forse molti o tutti, i membri del gruppo della borreliosi di Lyme perdono plasmidi nella cultura14. Il ceppo “adattato in laboratorio” meglio studiato di B. burgdorferi, B31, ha solo sette dei nove plasmidi trovati negli isolati selvatici di questa specie15. Allo stesso modo, B. garinii perde plasmidi in coltura16. Alcuni studi hanno dimostrato che le specie RF e B. miyamotoi conservano plasmidi quando coltivati14,17, ma recenti lavori dimostrano plasmidi alterati e infettività con la coltivazione in vitro a lungo termine 18.

I metodi basati sulla coltura rimangono il gold standard per la rilevazione di laboratorio delle infezioni batteriche, sia per la ricerca che per il lavoro clinico14,17. La coltura di agenti patogeni provenienti da fluidi corporei o tessuti rileva direttamente agenti patogeni replicanti e fornisce materiale di partenza per la ricerca14,17. Questo protocollo dimostra la metodologia e le ricette necessarie per coltivare con successo le spirochete del gruppo LB, nonché RF Borrelia e B. miyamotoi. Il terreno di base per la coltivazione delle spirochete Borrelia è il terreno di Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H disponibile in commercio), con o senza antibiotici per ridurre la crescita dei procarioti contaminanti. Questo mezzo è stato adattato da un mezzo originariamente utilizzato per supportare RF Borrelia19, ulteriormente modificato da Stoenner20 e poi da Barbour21. Da allora sono state sviluppate molte modifiche, ognuna con effetti sulla fisiologia batterica che possono influenzare la crescita, l’infettività e la patogenicità22. Questo mezzo supporta in modo affidabile la crescita delle spirochete nelle colture consolidate ed è stato utilizzato per isolare le spirochete da zecche, mammiferi e campioni clinici23. La variante più recente sviluppata, il terreno Kelly-Pettenkofer (MKP) modificato, può fornire un migliore successo di isolamento, morfologia e motilità quando si isolano nuovi isolati di Borrelia da campioni ambientali, quando il numero di spirochete presenti nel campione disponibile per seminare la coltura è basso23,24. In tutti i casi, il successo della coltivazione dipende in modo critico dal mezzo appena preparato e dall’uso di ingredienti appropriati; Non tutti gli ingredienti commerciali producono un mezzo di alta qualità. Le colture inoculate possono essere comodamente incubate senza agitazione in un incubatore convenzionale a 32-34 °C in presenza di una piccola quantità di ossigeno ambientale residuo. Le spirochete Borrelia sono anaerobe ma sono esposte in natura alle fluttuazioni delle concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica e rispondono con cambiamenti nell’espressione genica26,27,28,29. Pertanto, l’espressione genica, la crescita e altri studi metabolici dovrebbero controllare i livelli di ossigeno e anidride carbonica con l’uso di un incubatore controllato dall’ossigeno o di una camera anaerobica. In coltura, le colture vengono controllate settimanalmente, o più spesso, per la presenza di spirochete con microscopia in campo oscuro o microscopia a contrasto di fase. Gli strisci di coltura possono essere colorati con macchie d’argento, immunoistochimica o attraverso l’uso di ceppi marcati con fluorescenza29,30. La PCR seguita dal sequenziamento del DNA è un metodo sensibile e specifico per rilevare e identificare geneticamente o confermare la specie Borrelia 30,31,32,33.

Esistono molte varianti minori del BSK-II, e alcune sono disponibili in commercio. Il protocollo descritto qui nella sezione 1 è stato adattato da Barbour (1984)21. Il mezzo liquido MKP è un mezzo sviluppato più di recente ed è descritto nella sezione 2. Viene preparato secondo un protocollo33,34 precedentemente riportato, che, analogamente al mezzo BSK, consiste in due fasi: preparazione del mezzo di base e preparazione del mezzo completo. Il terreno di coltura Borrelia può essere preparato con o senza antibiotici, come descritto nel paragrafo 3; gli antibiotici agiscono per ridurre i batteri contaminanti introdotti durante l’inoculazione con campioni clinici o ambientali, come descritto nella sezione 4; se inoculati con coltura pura di Borrelia sp., gli antibiotici potrebbero non essere necessari. La produzione di scorte di Borrelia a lungo termine è spesso importante e un protocollo per farlo è descritto nella sezione 5. La sezione 6 descrive l’uso di questi mezzi per isolare cloni puri di Borrelia sensu lato da campioni clinici o ambientali. Ci sono un certo numero di approcci possibili36; Di seguito è riportato uno trovato efficace. Il mezzo di placcatura utilizzato in questo protocollo è una modifica del mezzo di placcatura BSK-II37 e del mezzo MKP 34 (con siero di coniglio aumentato al 10%38).

Protocol

Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da soggetti umani sono stati approvati dall’Institutional Review Board dell’Università e / o della struttura medica pertinente e il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti prima che i campioni fossero raccolti. Tutti gli studi che coinvolgono campioni ottenuti da animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida del Comitato etico istituzionale per gli animali. Se del caso, sono state ottenute le approvazioni per il campionamento ambien…

Representative Results

I terreni di coltura Borrelia BSK e MKP, e le varianti, sono terreni di coltura ricchi con ingredienti che devono essere preparati e sterilizzati in sequenza. Se preparato correttamente, il terreno BSK deve essere rosso-arancio e chiaro (Figura 1). La torbidità e le precipitazioni che persistono dopo il riscaldamento indicano ingredienti problematici, produzione media o contaminazione; Tale mezzo è meglio scartarlo. Se la gelatina viene aggiunta a BSK e con MKP, il mezzo sarà gel…

Discussion

La coltura di laboratorio dei batteri è il trampolino di lancio per la ricerca. Il profondo vantaggio conferito dalla capacità di cultura è esemplificato dalla lotta, nel corso di oltre un secolo culminata solo recentemente nel successo, alla cultura Treponema pallidum, la spirocheta che è l’agente eziologico della sifilide44. Le spirochete Borrelia sono anche impegnative per la cultura, ma la cultura è possibile 23,24,34,44,45,46,47,48,49.…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Natural Science and Engineering Research Council of Canada e dalla Canadian Lyme disease Foundation (AB e VL), dal Consiglio svedese delle ricerche (SB, M-LF e IN), DAL PROGETTO TAČR GAMA 2 – “Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS” (TP01010022) (MG e NR), e da una sovvenzione del Ministero della Salute della Repubblica Ceca NV19-05-00191 (MG e NR). Ringraziamo S. Vranjes (2021, Rudenko lab) per l’immagine in Figura 4 e J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) per le immagini in Figura 5. Ringraziamo tutti i ricercatori che hanno contribuito al campo e ci scusiamo con coloro il cui lavoro non siamo stati in grado di citare a causa di limitazioni di spazio.

Materials

1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item – any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item – any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item – any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item – any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item – any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item – any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item – any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item – any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item – any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item – any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item – any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item – any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important – see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item – any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item – any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item – any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item – any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item – any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item – any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item – any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item – any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top – ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item – any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item – any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item – any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item – any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item – any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item – any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item – any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item – any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item – any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item – any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item – any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item – any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item – any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item – any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item – any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item – any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item – any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item – any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item – any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item – any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item – any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item – any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item – any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item – any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item – any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item – any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item – any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item – any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item – any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item – any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item – any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item – any supplier will do
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References

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Berthold, A., Faucillion, M., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).
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