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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
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면역학 및 감염병학

Una tecnica ad alto rendimento basata sulla citometria a flusso per lo screening di farmaci inibitori delle integrine

Published: February 02, 2024
doi:
10.3791/64401
, , , ,
1Department of Immunology, School of Medicine,UConn Health, 2Center for Molecular Discovery,University of New Mexico Health Sciences Center, 3Comprehensive Cancer Center,University of New Mexico Health Sciences Center, 4Department of Pathology,University of New Mexico Health Sciences Center, 5Autophagy, Inflammation, & Metabolism (AIM) Center,University of New Mexico

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di screening ad alto rendimento basato sulla citometria a flusso per identificare farmaci a piccole molecole che inibiscono l’attivazione dell’integrina β2 sui neutrofili umani.

Abstract

Questo protocollo mira a stabilire un metodo per identificare piccoli antagonisti molecolari dell’attivazione dell’integrina β2, utilizzando anticorpi conformazionali che segnalano cambiamenti e citometria a flusso ad alto rendimento. Il metodo può anche fungere da guida per altri metodi di screening ad alto rendimento basati su anticorpi. Le integrine β2 sono molecole di adesione specifiche per i leucociti che sono cruciali nelle risposte immunitarie. I neutrofili si affidano all’attivazione delle integrine per uscire dal flusso sanguigno, non solo per combattere le infezioni, ma anche per essere coinvolti in molteplici malattie infiammatorie. Il controllo dell’attivazione dell’integrina β2 rappresenta un approccio praticabile per il trattamento delle malattie infiammatorie associate ai neutrofili. In questo protocollo, un anticorpo monoclonale, mAb24, che si lega specificamente al copricapo ad alta affinità delle integrine β2, viene utilizzato per quantificare l’attivazione dell’integrina β2 su neutrofili umani primari isolati. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) viene utilizzata come stimolo per attivare le integrine β2 dei neutrofili. In questo studio è stato utilizzato un citometro a flusso ad alto rendimento in grado di eseguire automaticamente campioni di piastre a 384 pozzetti. Gli effetti di 320 sostanze chimiche sull’inibizione dell’integrina β2 sono valutati entro 3 ore. Attraverso questo approccio è possibile identificare le molecole che prendono di mira direttamente le integrine β2 o le molecole bersaglio nella via di segnalazione di attivazione inside-out dell’integrina avviata dal recettore accoppiato alla proteina G.

Introduction

Molte malattie infiammatorie sono caratterizzate dall’infiltrazione di neutrofili nel sito di gonfiore o lesione1. Per infiltrarsi in questi tessuti, i neutrofili devono completare la cascata di reclutamento dei neutrofili, che comporta l’arresto dell’endotelio, lo stravaso attraverso la parete del vaso e il reclutamento nel tessuto2. I neutrofili circolanti hanno bisogno dell’attivazione dell’integrina β2 per completare questa cascata, specialmente per la fase di arresto. Pertanto, i farmaci inibitori dell’integrina che riducono l’adesione, lo stravaso e il reclutamento dei neutrofili possono trattare efficacemente le malattie infiammatorie 3,4.

Le integrine β2 sono già state prese di mira per le malattie infiammatorie. Efalizumab, un anticorpo monoclonale che ha come bersaglio diretto l’integrina αLβ2, è stato sviluppato per il trattamento della psoriasi5. Tuttavia, efalizumab è stato sospeso a causa del suo effetto collaterale letale: leucoencefalopatia multifocale progressiva derivante dalla riattivazione del virus JC 6,7. Le nuove terapie antinfiammatorie a base di integrine dovrebbero prendere in considerazione il mantenimento delle funzioni anti-infezione dei leucociti per ridurre al minimo gli effetti collaterali. Gli effetti collaterali di efalizumab potrebbero essere dovuti alla circolazione prolungata di anticorpi monoclonali nel flusso sanguigno, che potrebbero inibire le funzioni immunitarie a lungo termine8. Uno studio recente mostra che efalizumab media la reticolazione di αLβ2 e l’internalizzazione indesiderata delle integrine α4, fornendo una spiegazione alternativa per gli effetti collaterali9. Pertanto, gli antagonisti di piccole molecole di breve durata potrebbero evitare questo problema.

Di seguito viene presentato un metodo ad alto rendimento per lo screening di antagonisti dell’integrina β2 a piccole molecole utilizzando neutrofili umani. L’attivazione dell’integrina β2 richiede cambiamenti conformazionali dell’ectodominio dell’integrina per ottenere l’accesso e aumentare la sua affinità di legame con il suo ligando. Nel modello canonico a serramanico, l’ectodominio integrinico piegato-chiuso si estende prima a una conformazione estesa-chiusa e poi apre il suo copricapo a una conformazione estesa-aperta completamente attivata10,11,12,13. C’è anche un percorso alternativo che parte dal piegato-chiuso al piegato-aperto e all’esteso-aperto, infine 14,15,16,17,18,19. L’anticorpo conformazionale specifico mAb24 si lega a un epitopo nel dominio β2-I-like umano quando il copricapo dell’ectodominio è aperto20,21,22,23.

In questo caso, mAb24-APC viene utilizzato per determinare se le integrine β2 sono attivate. Per attivare i neutrofili e l’integrina, la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un peptide chemiotattico corto di derivazione batterica in grado di attivare le integrine β2 dei neutrofili24, viene utilizzato come stimolo in questo protocollo. Quando la fMLP si lega alla Fpr1 sui neutrofili, vengono attivate cascate di segnalazione a valle che coinvolgono le proteine G, la fosfolipasi Cβ e la fosfoinositide 3-chinasi γ. Questi eventi di segnalazione alla fine provocano l’attivazione dell’integrina attraverso la via di segnalazione inside-out18,25. Oltre agli antagonisti di piccole molecole che si legano direttamente alle integrine β2 e prevengono i cambiamenti conformazionali dell’attivazione delle integrine26, con questo metodo verrebbero rilevati anche composti che possono inibire i componenti nella via di segnalazione di attivazione dell’integrina β2 inside-out. I citometri a flusso automatizzati consentono uno screening ad alta produttività. L’identificazione di nuovi antagonisti può non solo approfondire la nostra comprensione della fisiologia delle integrine, ma anche fornire informazioni traslazionali sulla terapia antinfiammatoria a base di integrine.

Protocol

I campioni di sangue intero eparinizzato sono stati ottenuti da donatori umani sani non identificati dopo aver ottenuto il consenso informato, come approvato dall’Institutional Review Board di UConn Health, seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i donatori. I criteri di inclusione/esclusione per questo studio sono stati accuratamente sviluppati per garantire l’idoneità dei partecipanti e per ridurre al minimo i rischi potenziali. I partecipanti idonei avevan…

Representative Results

I dati di uno screening rappresentativo su piastra a 384 pozzetti (Figura 4) hanno rivelato che i controlli negativi avevano un MFI di mAb24-APC di 3236 ± 110, mentre i controlli positivi avevano un MFI di mAb24-APC di 7588 ± 858. Il fattore Z’ per questa piastra è di circa 0,33, che rientra in un intervallo accettabile31. Tuttavia, Z’ richiede un’ulteriore convalida nei saggi secondari. Per normalizzare i dati, tutti i valori sono stati…

Discussion

L’inizio e la fine della stimolazione e della colorazione dei neutrofili sono determinati dall’aggiunta di neutrofili e del fissativo PFA. Pertanto, è fondamentale garantire lo stesso intervallo di tempo tra il pipettaggio dei neutrofili o del PFA in ciascuna colonna. Ciò garantisce che il tempo di stimolazione e colorazione dei neutrofili da ciascun pozzetto rimanga costante. A causa della breve durata di vita dei neutrofili, l’intero esperimento, dalla raccolta del sangue dai donatori al completamento della citometri…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dr. Evan Jellison e la Sig.ra Li Zhu nel nucleo di citometria a flusso presso UConn Health per la loro assistenza con la citometria a flusso, la Dott.ssa Lynn Puddington nel Dipartimento di Immunologia presso UConn Health per il suo supporto agli strumenti, la Sig.ra Slawa Gajewska e il Dr. Paul Appleton nel nucleo di ricerca clinica presso UConn Health per il loro aiuto nell’ottenere campioni di sangue. Ringraziamo il Dr. Christopher “Kit” Bonin e la Dr.ssa Geneva Hargis della UConn School of Medicine per il loro aiuto nella scrittura scientifica e nella revisione di questo manoscritto. Questa ricerca è stata supportata da sovvenzioni del National Institutes of Health, del National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), del National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, di un premio per lo sviluppo della carriera dell’American Heart Association (18CDA34110426) e di un fondo di avvio di UConn Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Materials

16-channel pipettes Thermo 4661090N Instrument
384-well plate Greiner 784201 Materials
APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24 BioLegend 363410 Reagents
Bravo Automated Liquid Handling Platform  Agilent 16050-102 384 multi-channel liquid handler
Centrifuge Eppendorf Model 5810R Instrument
FlowJo Becton, Dickinson & Company NA Software
Human Serum Albumin Solution (25%) GeminiBio 800-120 Reagents
Lifitegrast Thermofisher  50-208-2121 Reagents
Nexinhib20 Tocris 6089 Reagents
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) Sigma F3506 Reagents
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences 15710 Reagents
Plate buckets Eppendorf UL155 Accessory
Plate shaker  Fisher 88-861-023 Instrument
PolymorphPrep PROGEN 1895 (previous 1114683) Reagents
Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM) Prestwick Chemical Libraries Ver19_384 1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)
RPMI 1640 Medium, no phenol red Gibco 11-835-030 Reagents
Swing-bucket rotor  Eppendorf A-4-62 Rotor
ZE5 Cell Analyzer Bio-Rad Laboratories Model ZE5 Instrument
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Cao, Z., Garcia, M. J., Sklar, L. A., Wandinger-Ness, A., Fan, Z. A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs. J. Vis. Exp. (204), e64401, doi:10.3791/64401 (2024).
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