Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi

1. Hücre kültürü protokolü Birincil insan miyoblast kültürüHücre dışı matrisi (ECM) buz üzerinde 8 mL DMEM/F12 ortamında 1:100 oranında seyreltin. Bir T175 şişesine 8 mL ECM çözeltisi uygulayın ve hücre tohumlamadan önce en az 1 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin, ancak en fazla 24 saat inkübe edin. ECM çözeltisinin tüm şişe tabanını kapladığından emin olun. İskelet kası büyümesinin 5 mL’lik bir Aliquot’u, 15 mL’lik bir konik tüpe kadar. Dondurulmuş bir şişe hücreyi (5.0 x 105 miyoblast) 37 ° C’de bir su banyosunda 2 dakika boyunca veya buz eriyene kadar çözün. Şişeye% 70 etanol püskürtün ve bir biyogüvenlik kabinine (BSC) aktarın. Bir P1000 kullanarak hücreleri aliquoted ortama aktarın. Triturasyon yapmayın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir P1000 pipet kullanarak büyüme ortamının 1 mL’sindeki hücreleri yeniden askıya alın. ECM kaplı şişeyi 15 mL DPBS ile yıkayın. DPBS’yi aspire edin ve ardından şişeye 30 mL büyüme ortamı ekleyin. Hücrelere 4 mL büyüme ortamı ekleyin, hücre süspansiyonunu karıştırın ve T-175 şişesine dağıtın. Toplam hacmin 35 mL olduğundan emin olun. Şişe yüzeyindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için şişeyi çalışma yüzeyi boyunca yavaşça sola ve sağa 5-6 kez kaydırın, ardından 5-6 kez ileri ve geri kaydırın. T-175 şişesini 37 ° C’de ve% 5 CO2’de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreleri 3 gün boyunca veya% 70’ten fazla akıcılığa ulaşmayana kadar kültürleyin ve ardından hücreleri geçirin. Pasajlı birincil insan miyoblastlarıECM’yi buz üzerinde 30 mL DMEM/F12 ortamında 1:100 oranında seyreltin. Üç T225 şişesine 10 mL ECM çözeltisi uygulayın ve hücre tohumlamadan önce en az 1 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin, ancak en fazla 24 saat inkübe edin. ECM çözeltisinin tüm şişe tabanını kapladığından emin olun. Hücreleri 15 mL DPBS ile yıkayın. Aspire edin ve satıcının protokolüne göre ayrışma reaktifini ekleyin. Hücreler kaldırıldıktan sonra, satıcının protokolüne göre reaksiyonu durdurun ve hücreleri konik bir tüp halinde toplayın. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir P1000 pipet kullanarak büyüme ortamının 1 mL’sindeki hücreleri yeniden askıya alın. ECM kaplı şişeyi 15 mL DPBS ile yıkayın. DPBS’yi aspire edin ve ardından her T225 şişesine 40 mL büyüme ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonuna 14 mL büyüme ortamı ekleyin, karıştırın ve her T225 şişesine 5 mL’lik hücre süspansiyonunu dağıtın. Her şişedeki toplam hacmin 45 mL olduğundan emin olun. Eşit dağılımı sağlamak için şişeyi çalışma yüzeyi boyunca yavaşça sola ve sağa 5-6 kez, ardından 5-6 kez ileri ve geri kaydırın. Şişeleri hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C’de ve% 5 CO2’ye yerleştirin. Kültür hücreleri 2-3 gün boyunca veya% 70’ten fazla bir akıcılığa ulaşmayana kadar ve sonra geçer. Hücreleri her geçişte 1:3 veya 1:4’te bölün ve 3 x 103 ile 1 x 104 hücre/cm2 arasında tohumlayın. hiPSC kaynaklı kardiyomiyosit kültürüECM’yi buz üzerinde 12 mL DMEM/F12 ortamında 1:60 oranında seyreltin. İki adet 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ECM çözeltisi uygulayın ve hücre tohumlamasından önce en az 1 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin, ancak en fazla 24 saat. Dondurulmuş bir kardiyomiyosit şişesini 37 ° C’de bir su banyosunda 2 dakika boyunca veya buz eriyene kadar çözün. Şişeye% 70 etanol püskürtün ve BSC’ye aktarın. Çözülmüş hücreleri 50 mL’lik konik bir tüpe aktarmak için bir p1000 pipet kullanın. Kalan hücreleri geri kazanmak için boş kriyovyali 1 mL oda sıcaklığı (RT) kaplama ortamı ile durulayın. 1 mL durulama ortamını damla damla (her 5 saniyede bir damla) 90 sn boyunca hücrelerin konik tüpüne yavaşça dağıtın. Yavaş ortam ekleme sırasında hücreleri karıştırmak için tüpü sürekli döndürün. 50 mL’lik konik hücre tüpüne 10 mL’lik bir serolojik pipet kullanarak 8 mL’lik kaplama ortamını yavaşça ekleyin. Tüm ortamlar dağıtıldıktan sonra, hücreleri iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı 3 kez pipet yapın. Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. 50 mL konik tüpteki hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. Hücreler peletlendikten sonra, süpernatanı aspire edin. Kaplama ortamının 1 mL’sini tüpe aktarmak için bir p1000 pipet kullanın ve 3-5 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetle çekerek peleti yavaşça parçalayın. Hücreleri ek bir kaplama ortamı ile yeniden askıya alın. Kaplama ortamının 2 mL’sinde 6 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 2-4 x 106 hücre arasında tohumlayın. ECM kaplı 6 delikli plakaları DPBS (2 mL/kuyu) ile yıkayın. Pipet, 6 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 2 mL hücre süspansiyonu. Plaka yüzeylerindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakaları çalışma yüzeyi boyunca yavaşça sola ve sağa 5-6 kez sola ve sağa hareket ettirin, ardından 5-6 kez ileri ve geri hareket ettirin. Plakayı hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C’de ve% 5 CO2’ye yerleştirin. Çözülecek hücrelerin tüm şişeleri için 1.3.3-1.3.16 arasındaki adımları yineleyin. Kaplamadan sonraki ertesi gün bakım ortamının 3-5 mL’sine (hücre hattına ve yoğunluğuna bağlı olarak) değiştirin ve ardından ortamı her iki günde bir değiştirin. 3D dokulara dökülmeden önce 3-4 gün boyunca kültür hücreleri. Stromal hücre kültürüBir T175 şişesine 30 mL ECM çözeltisi uygulayın ve hücre tohumlamadan önce en az 1 saat boyunca 37 ° C’de inkübe edin, ancak en fazla 24 saat inkübe edin. Aliquot 5 mL stromal hücre ortamı 15 mL konik tüp içine. Dondurulmuş bir stromal hücre şişesini 37 ° C’de bir su banyosunda 2 dakika boyunca veya buz eriyene kadar çözün. Şişeye% 70 etanol püskürtün ve BSC’ye aktarın. Şişedeki çözülmüş hücrelere stromal hücre ortamının 1 mL’sini yavaşça eklemek için bir p1000 pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu şişeden konik tüpteki kalan çözülme ortamına aktarın. Hücreleri karıştırmak için 5 mL’lik bir serolojik pipet kullanın. Pipetleri 3 kez yukarı ve aşağı doğru çevirin. Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri aşağı çevirmeyin. ECM kaplı T175 şişeyi 15 mL DPBS ile yıkayın. Stromal hücreleri şişeye 3-4 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta aktarın. Şişe yüzeyindeki hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için şişeyi çalışma yüzeyi boyunca yavaşça sola ve sağa 5-6 kez kaydırın, ardından 5-6 kez ileri ve geri kaydırın. Ertesi gün 45 mL ısıtılmış stromal hücre ortamı ile medyayı değiştirin. 3D dokulara dökülmeden önce hücreleri 3-4 gün boyunca kültürleyin. 2. Malzeme hazırlama FibrinojenNOT: Fibrinojen yeniden yapılandırılırken, fibrinojen tozunun katmanlandığı yüzey alanı miktarını en üst düzeye çıkarmaya dikkat edin. Bu protokolde, kullanılan seyreltici miktarı, kullanılan kabın boyutuna göre optimize edildi, yani kabın tabanını örtmek için yeterli seyreltici kullanıldı. Örneğin, 50 mL’lik bir santrifüj tüpü yerine 100 mm’lik bir kapta 10 mL PBS’nin üzerinde 0,5 g fibrinojen tabakası. Seyrelticinin yüzey alanı miktarını en üst düzeye çıkarmak, fibrinojen yeniden oluşturmak için gereken süreyi azaltacak ve proteinin potansiyel kümelenmesini azaltacaktır.Yeniden yapılanma10 mL PBS’yi 100 mm’lik bir hücre kültürü kabına aktarın ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C’ye ısıtın. Sıcak PBS’nin tüm yüzeyi üzerinde 0.5 g fibrinojen tozu tabakası ve fibrinojen tamamen çözünene kadar 37 ° C’de tutun. Bu 2 saatten fazla sürmemelidir. Çözünen toz hafifçe döndürülebilir, ancak çanağı kuvvetlice sallamayın. Steril filtrasyonToz tamamen çözündükten sonra, çözeltiyi 100 μm’lik bir filtreden geçirin ve jelleşmiş fibrinojen kümelerini çıkarmak için 50 mL’lik bir konik tüp içinde toplayın. Filtrelenmiş çözeltiyi, 0,2 μm’lik bir filtreyle kaplanmış 10 mL’lik bir şırıngaya dökün. Çözeltiyi filtreden geçirin ve yeni bir 50 mL konik tüp içinde toplayın. 10 mL’lik çözeltinin tamamını sterilize etmek için filtrenin birden fazla kez değiştirilmesi gerekebilir. Aliquot 300 mL steril fibrinojen 1.5 mL mikrosantrifüj tüplere ve -20 ° C’de saklayın. Alikotları buz üzerinde veya gerektiğinde 4 ° C’de çözün. Tekrarlanan donma/çözülmelerden kaçının. Trombin100 U/mL trombin stok çözeltisi oluşturmak için 6 mL PBS ve 4 mL diH2O doğrudan bir şişe trombin (1 KU) ekleyin. Filtre, 0,2 μm filtre, aliquot ile sterilize edin ve -20 °C’de 1,5 mL plastik mikrosantrifüj tüplerinde trombin cama adsorbe olarak saklayın. Tekrarlanan donma/çözülmelerden kaçının. Poli(etilenimin) çözeltisi (PEI)DİKKAT: PEI toksiktir. Üretici tarafından belirlenen uygun KKD’yi kullanın.NOT: PEI, w/v çözeltisi olarak tedarik edilir. Son derece viskozdur ve pipet uygulaması zordur. Doğrudan w/v çözeltisinden değil, ‘luk bir stok çözeltisinden %0,1’lik bir çözüm üretin.50 mL’lik konik bir tüpte 5 mL’lik w/v PEI çözeltisi ölçün. 20 mL diH2O ekleyin ve% 10’luk bir stok çözeltisi elde etmek için karıştırın. Bu yüksek konsantrasyonlu stok çözeltisi steril filtrelenemez. Hücre kültürü için %0,1’lik bir çözelti oluşturmak için, 500 mL’lik bir filtre şişesi kullanarak 495 mL diH2O. Steril filtreye 5 mL’lik ‘luk bir stok ekleyin ve RT’de 1 haftadan fazla olmamak üzere saklayın. GlutaraldehitDİKKAT: Glutaraldehit toksiktir. Üretici tarafından belirlenen uygun KKD’yi kullanın.Glutaraldehit% 25’lik bir çözelti olarak verilir. % 0.01’lik bir çözelti oluşturmak için, 99.6 mL’ye 40 μL diH2O. Steril filtre ekleyin ve 1 haftadan fazla olmamak üzere 4 ° C’de saklayın. Hazırlık sonrasıSarf malzemesi doku döküm kitini steril bir kültür davlumbazının içine yerleştirin. Döküm kiti bir kapak, 24 çift direk tutan bir direk kafesi (24 delikli bir plakanın kuyusu başına bir çift direk) ve 24 döküm kuyusu içeren özel bir 24 delikli plaka tabanı içerir. Her döküm kuyusu, hücre/hidrojel bileşenlerini tutmak ve hidrojel polimerize olurken bunları tüp şeklinde bir dokuya kalıplamak için kuyunun dibinde bir hendek içerir (Şekil 1B). 24 delikli bir plakanın kuyularını% 0,1’lik bir PEI çözeltisinin 1,5 mL/kuyucuğu ile doldurun ve her bir direk çiftinin uçları suya batırılacak şekilde plakaya direkler yerleştirin. PEI, direkler üzerinde pozitif bir yük biriktirir, böylece hidrojeldeki proteinler doku dökümü sırasında direklere sıkıca yapışır. İkinci bir 24 delikli plakanın kuyularını 2 mL / kuyucuk steril diH2O ile doldurun ve direkleri aktarın. 1 dakika bekletin. Üçüncü bir 24 delikli plakada, kuyucukları 1,5 mL / kuyucuk% 0,01 glutaraldehit (GA) ile doldurun ve direkleri aktarın. 30 dakika bekletin. GA, PEI’den direklere pozitif yükü sabitleyecektir. Direkler glutaraldehit içinde otururken, diH 2 O kuyucuklarını aspire edin, 2 mL / steril diH 2 O kuyusu ile yıkayın, aspire edin ve2mL / steril diH2O kuyusu ile doldurun. Durulama yerine taze, 24 delikli bir plaka kullanılabilir. 30 dakika dolduğunda, direkleri steril diH 2 O’nun2mL / kuyucuğuna aktarın. 1 dakika bekletin. diH 2 O’yuaspire edin ve 2 mL / kuyucuk daha steril diH2O ekleyin. 5 dakika bekletin. Direkleri kuruması için 24 delikli bir plakaya aktarın (yaklaşık 15 dakika). Kuruduktan sonra, döküm Kitini yeniden monte edin. Kapağı ve plakayı birbirine kapatmak için kenarları parafilm haline getirin ve daha sonra hücre tohumlamadan önce 72 saate kadar 4 ° C’de saklayın. Daha uzun depolama süreleri muhtemelen mümkündür, ancak test edilmemiştir. 3. Doku döküm protokolü Döküm plakası hazırlamaDoku döküm kitini 4 °C’de önceden soğutun. BSC’ye bir kova buz aktarın. Buz üzerinde, dökülecek kuyucuk başına 50 μL trombin çözeltisi (3 μL trombin stoğu + 47 μL EMT ortamı) hazırlayın.NOT: EMT ortamıyla ilgili ayrıntılar için adım 3.2.1’e bakın. Soğutulmuş döküm kitini buzdolabından çıkarın ve hücre kültürü davlumbazının içindeki soğuk bir bloğa veya buza yerleştirin. Döküm plakasını düz bir şekilde buzun üzerine yerleştirin ve post kafesi döküm plakasından yeni, steril 24 delikli bir plakaya taşıyın. Pipet, döküm plakasının önceden soğutulmuş her bir kuyucuğuna 50 μL trombin çözeltisi verir. Kiti yeniden monte edin ve doku dökümü için gerekli olana kadar buzdolabına geri koyun. Dokuları kuyucuklara ek olarak trombinden 3 saat içinde dökün. Hücre hazırlığıEMT baz ortamını, steril filtreyi hazırlayın ve buz üzerinde bırakın.NOT: Hücreye özgü döküm ortamı FBS içeriyorsa, fibrinojen ile etkileşime girebileceği ve erken polimerizasyona neden olabileceği için ısıda inaktive edilmiş FBS kullanın.Kardiyak EMT ortamı hazırlayın: 500 mL RPMI ortamı, 10 mL B27 ve 2.5 g aminokaproik asit ekleyin. (İsteğe bağlı) 10 mM ROCK inhibitörü ekleyin (500 mL hacminin tamamını değil, sadece dokuları dökmek için kullanılan EMT ortamına ekleyin). İskelet EMT ortamını hazırlayın: Birincil EMT’ler için 50 mL F10 ortamı ve 0.25 g aminokaproik asit (ACA) ve iPSC türevi EMT’ler için 0.1 g ACA ekleyin. Hücre kültürü sınıfı ayrışma reaktifini 37 °C’ye ısıtın. Ayrışma reaktifini seyreltmek için eşit miktarda EMT ortamını ısıtın.NOT: Kullanılan proteazın tamamen inaktive edilmesi çok önemlidir. Aktif proteaz, 3D doku oluşumuna ve postveransa müdahale edecektir. Hücreleri (Şekil 1A) PBS ile yıkayın. 6 delikli bir plaka için 2 mL/kuyu kullanın. 100 mm’lik bir çanak, T175 şişe ve T225 şişe için sırasıyla 6 mL, 15 mL ve 15 mL kullanın. Hücreleri kaldırmak için ısıtılmış hücre kültürü sınıfı ayrışma reaktifini ekleyin ve 5 dakika boyunca veya hücreler kalkana kadar 37 ° C’de inkübe edin. Kardiyak kültürler için, 10x ayrışma reaktifini kullanın. Stromal hücreler ve iskelet kası miyoblastları için, 1x ayrışma reaktifi kullanın. 6 delikli bir tabak için 1 mL/kuyucuk, 100 mm’lik bir tabak için 3 mL, T175 şişe için 8 mL ve T225 şişe için 10 mL kullanın. Plakanın yan tarafına dokunarak kültürleri her 2-3 dakikada bir kontrol edin. Hücreler kaldırıldıktan sonra, bunları 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için bir P1000 pipetle tritüre edin. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpe eklemek için plakayı veya şişeyi ek bir EMT ortamı ile yıkayın. 6 delikli bir tabak için EMT ortamının 1 mL/kuyucuğunu, 100 mm’lik bir çanak için 2 mL’yi, T175 şişesi için 5 mL’yi ve bir T225 şişesi için 5 mL’yi kullanın. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri tritüre edin. Ayrışma işlemini sonlandırmak için EMT ortamı ekleyin ve ardından hücre sayımları için hücre süspansiyonlarının örneklerini alın. 6 delikli bir tabak için 1 mL/kuyucuk, 100 mm’lik bir tabak için 3 mL, T175 şişe için 8 mL ve T225 şişe için 10 mL kullanın. Hücreleri 4 dakika boyunca 200 x g’de döndürün. Süspansiyonlar santrifüjlenirken bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücre sayımları yapın. Süpernatantı aspire edin ve artık ayrışma reaktifini çıkarmak için hücreleri 5 mL EMT baz ortamında yeniden askıya alın. Hücreleri 4 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve hücre süspansiyonlarını uygun yoğunluklarda hazırlayın. EMT ortamı 14,16’da% 10-20% ECM proteinlerinin eklenmesiyle 3D iskelet kası EMT’lerinin ömrünü ve işlevini artırın. Tohum kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler ve stromal hücreleri, doku başına sırasıyla 5 x 10 5 hücre ve7.5 x 104 hücre yapısıdır. İskelet kası miyoblastlarını doku yapısı başına 7.5 x 105 hücrede tohumlayın. Kardiyak dokularSüpernatantı aspire edin ve stromal hücreleri EMT ortamında mL başına 2.5 x 106 hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın ve buza koyun. EMT başına bu süspansiyonun 30 μL’sini kullanın. Süpernatantı aspire edin ve CM’leri EMT ortamında mL başına 8.3 x 106 hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın ve buza koyun. EMT başına bu süspansiyonun 60 μL’sini kullanın. İskelet kas dokularıSüpernatantı aspire edin ve iskelet kası hücrelerini EMT ortamında mL başına 8.3 x 106 hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın ve buza koyun. EMT başına bu süspansiyonun 90 μL’sini kullanın. İstenilen doku sayısını oluşturmak için gereken her hücre çözeltisinin hacimlerini hesaplayın (örneğin, hazırlanan CM’lerin 60 μL’si ve hazırlanan stromal hücrelerin 30 μL’si veya EMT başına iskelet kası hücrelerinin 90 μL’si). Hesaplanan hücre hacimlerini 15 mL’lik bir konik tüpe pipetleyin. Hücre süspansiyonuna EMT başına 10 μL fibrinojen ekleyin ve buz üzerinde tutun. EMT başına toplam reaktifler ve hücre hacimleri: Her EMT’nin 90 μL hücre, 10 μL fibrinojen ve 50 μL trombin çözeltisine sahip olduğundan emin olun. Doku dökümüDoku döküm kitini bir hücre kültürü başlığına aktarın ve kapağı çıkarın (esnek ve sert direkler içeren post kafes döküm plakasında kalmalıdır; Şekil 1B). Döküm plakasını post kafes ile buz üzerinde düz bir şekilde yerleştirin. Hücre/fibrinojen karışımını karıştırın ve bir P200 pipet ile 100 μL çekin. 50 μL trombin çözeltisi ile hazırlanan kuyucuklara 100 μL karışım ekleyin ve iyice karıştırmak için 5 kez tritüre edin. Pipetin ilk durağın ötesine itilmemesi ve herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemek için tritürasyondan sonra ucu çıkarmayın. Bu aşamada ve post kafes döküm plakasından kaldırılmaya hazır olana kadar (adım 3.3.10), kafesin herhangi bir hareketi, dokunun direklere uzun süreli bağlanmasını tehlikeye atabilir. Kafesin herhangi bir hareketini önlemek için hem kafesi hem de döküm kuyusu plakasını aynı anda bir elin işaretçi parmağını ve başparmağını kullanarak tutun. Tüm dokular dökülene kadar her doku için taze bir P200 ucu ile tekrarlayın. Hücreler hızla yerleştikçe her dokuyu dökmeden önce hücre süspansiyonunu 15 mL’lik bir konik tüpte karıştırın. Tohumlu kiti dikkatlice inkübatöre aktarın, kafesi hareket ettirmediğinizden emin olun. Tohumlamadan sonra kafesin hareketi, dokuların döküm kuyularından aktarılmasında başarının azalmasına neden olabilir. Hücre tipine bakılmaksızın 80 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Bu, hidrojelin polimerizasyonuna başlayacak ve proteinlerin direklere yapışmasına izin verecektir. Bu arada, kalp dokuları için EMT ortamının 2 mL / kuyucuğu ile taze bir 24 delikli plaka hazırlayın. İstenirse EMT ortamına 10 mM ROCK inhibitörü eklenebilir. Ortamı ısıtmak için plakayı 37 ° C’de inkübe edin. Birincil iskelet kası dokuları için 5 g / L aminokaproik asit (0.2 mm steril filtrelenmiş) veya iPSC türevi EMT’ler için 2 g / L ACA içeren 2 mL / kuyucuk büyüme ortamı hazırlayın. Ortamı ısıtmak için plakayı 37 ° C’de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, döküm kuyularının kenarına yavaşça 1 mL EMT ortamı ekleyin ve hücre tipine bakılmaksızın 37 ° C’de 10 dakika daha inkübe edin. Bu, hidrojeli döküm kuyusunun kenarlarından çıkaracak ve dokunun kolay transferine izin verecektir. 10 dakika sonra, post kafesi dikkatlice kaldırın ve dokuları döküm plakasından orta dereceli hazırlanmış 24 delikli bir plakaya aktarın (Şekil 1C). Dokulu plakaları 37 °C’de hücre kültürü inkübatörüne geri getirin. Bakım24 saat sonra, döküm dokuları EMT ortamının 2 mL / kuyucuğu (dahil edilmişse ROCK inhibitörü olmadan) içeren taze bir 24 delikli plakaya aktarın ve 37 ° C’de inkübe edin. İskelet kası hücreleri için, miyoblast füzyonunu teşvik etmek için büyüme ortamını farklılaşma ortamına geçirin. Kardiyak dokuları her 2-3 günde bir EMT ortamının 2 mL/kuyucuğu ile taze kuyucuklara aktarın. İskelet kası dokularını her 2-3 günde bir 5 g / L Aminokaproik asit (0.2 mm steril filtrelenmiş) içeren 2 mL / kuyu farklılaşma ortamı ile taze kuyucuklara aktarın. iPSC türevi dokular için 2 g/L ACA kullanın. Orta dereceli değişikliklere yardımcı olmak için, 3D dokulara zarar vermemek için ortamı aynı plakada değiştirmek yerine post kafesi taze bir 24 delikli plakaya aktarın. EMT ortamı ile ikinci bir 24 delikli plaka hazırlayın ve dokuları taze ortama aktarın. Bir sonraki ortam değişimi için kullanmak üzere plakayı aktif kültürün yanında eski ortamla birlikte tutun. Post kafesi kültür dönemi boyunca iki plaka arasında ileri geri aktarın. Alternatif olarak, her ortam değişimi için taze bir plaka kullanın. EMT büzülmesini, sapma sonrası optik izleme (Şekil 1D) veya manyetik algılama donanımı13,14 ile ölçün. Kalp dokuları kültürde 3-4 gün sonra kendiliğinden atmaya başlar. İskelet kası dokuları tipik olarak kültürde 7 gün sonra elektriksel alan stimülasyonu ile kasılmaktadır.