Mesure de la contractilité cardiaque dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés

Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations en vigueur. Tous les cœurs humains utilisés pour les études n’étaient pas transplantables et ont été obtenus de manière éthique par consentement légal éclairé (première personne ou plus proche parent) de donneurs d’organes cadavériques aux États-Unis. Les protocoles de récupération et l’expérimentation in vitro ont été pré-approuvés par les comités d’examen institutionnels (IRB) des centres de transplantation au sein du réseau américain d’approvisionnement en transplantation d’organes (OPTN). De plus, tous les transferts de cœurs de donneurs sont entièrement traçables et examinés périodiquement par les autorités fédérales américaines. REMARQUE : Appliquer toutes les procédures de sécurité nécessaires pendant l’exécution de ce protocole, y compris le port de l’équipement de protection individuelle approprié (p. ex., blouses de laboratoire, lunettes de sécurité, gants). 1. Isolement des cardiomyocytes (1 jour avant la mesure de la contractilité) Reperfuser les cœurs des donneurs dès leur arrivée au laboratoire avec une solution cardioplégique exclusive glacée6 et isoler enzymatiquement les myocytes primaires humains adultes des ventricules 11,12,13,14,15. Ensuite, maintenez les cardiomyocytes en suspension et conservez-les avec 10 mL de solution A (110 mM de saccharose, 0,005 mM de CaCl 2, 3 mM de MgCl 2, 70 mM de KOH, 60 mM d’acide lactobionique, 10 mM de KH 2 PO4, 20 mM de taurine, 20 mM de L-histidine, 20 mM de HEPES, 2 mM d’acide L-glutamique, 2 mM d’acide L-(-)-malique, pH 7,4 avec KOH) dans des flacons de Wheaton de 20 ml (tableau des matériaux) à une température réfrigérée jusqu’à ce qu’ils soient interrogés expérimentalement.REMARQUE : Conservez 200 000 cellules par flacon. 2. Préparation de l’enrobage de laminine (1 jour avant la mesure de la contractilité) Placez une seule lamelle de verre (carré de 25 mm x 25 mm, tableau des matériaux) dans chaque puits d’une plaque de culture à huit puits (tableau des matériaux). Ensuite, enduisez les lamelles de laminine à une concentration de 5 μg/mL. Pour ce faire, ajouter 800 μL de laminine 521 recombinante humaine (Table des matériaux, stockée à −20 °C) à 7,2 mL de solution B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM de glucose et 10 mM HEPES, pH 7,4 avec NaOH) et bien mélanger. Déposez 200 μL de la solution de laminine diluée au centre de chaque lamelle. Ensuite, couvrez l’assiette et empilez-la au réfrigérateur à 4 °C.REMARQUE : Préparez plusieurs plaques de culture à huit puits pour vous assurer qu’il y a suffisamment de lamelles recouvertes de laminin. 3. Préparation des cardiomyocytes tolérants au Ca2+ (le jour de la mesure de la contractilité) Sortez un flacon de cellules du réfrigérateur, aspirez la solution A du flacon et ajoutez 10 mL de solution B réfrigérée.REMARQUE : Assurez-vous que les cellules ne sont pas aspirées et dispersez la solution B dans le flacon en plaçant la pipette à l’intérieur du haut de la paroi du flacon. Fermez le flacon de cellules, puis remuez doucement pour vous assurer que les cellules sont dispersées dans la solution B. Enfin, laissez les cellules se déposer pendant 1 h à température ambiante (RT). 4. Préparation du système d’enregistrement (le jour de la mesure de la contractilité) REMARQUE : Le système d’enregistrement comprend un boîtier de contrôle de la température, un stimulateur, une perfusion sous pression contrôlée par ordinateur, des bouteilles de perfusion sous pression, un logiciel d’acquisition interne permettant la sélection des régions d’intérêt (ROI) et l’affichage des transitoires de contractilité, un microscope inversé, une chambre cellulaire et une caméra (Figure 1). Allumez le système d’aspiration par aspiration. Ensuite, retirez le couvercle du microscope, allumez-le, connectez la caméra (Table des matériaux, Figure 1) et, enfin, vérifiez que le ventilateur est allumé pour vous assurer que la caméra ne surchauffe pas. Ensuite, allumez la plaque chauffante du microscope (Table des matériaux) et le boîtier de contrôle de la température (Table des matériaux, Figure 1) et réglez-les à la température de fonctionnement appropriée. Ensuite, allumez le stimulateur de champ (tableau des matériaux, Figure 1) et le système de pression. Enfin, connectez le tube de la solution (tableau des matériaux) à la chambre d’enregistrement (tableau des matériaux, Figure 1). 5. Préparation des composés d’essai (le jour de la mesure de la contractilité) Sulfoxyde de diméthyle dilué (DMSO ; Table des matériaux) 1 000 fois dans la solution C (145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2, 11,1 mM de glucose et 10 mM de HEPES, pH 7,4 avec NaOH) pour obtenir une solution de véhicule à 0,1 % de DMSO. Pour tester un composé à 1, 10 fois, 100 fois et 1000 fois de son exposition thérapeutique de 0,001 μM, dissoudre le composé d’essai dans du DMSO à une concentration de 1 mM. Diluer cette solution en série avec du DMSO pour produire trois autres stocks de DMSO (par exemple, 0,001 mM, 0,01 mM et 0,1 mM). Enfin, diluer 1 000 fois chaque composé d’essai dans 100 mL de solution C pour obtenir les concentrations d’essai finales (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM et 1 μM). Ajouter la solution du véhicule et les solutions des concentrations micromolaires finales du composé dans des flacons en verre de 100 ml (tableau des matériaux, figure 1), puis raccorder les flacons au système de perfusion sous pression (tableau des matériaux, figure 1). Ensuite, amorcez le système de perfusion à l’aide d’un programme informatisé (Table des matériaux) en utilisant une pression de 200 à 300 mbar pour fournir un débit de perfusion constant à un débit de 1,8 mL/min.REMARQUE : Ne pas effectuer l’expérience si le composé d’essai est associé à un problème de solubilité. De plus, formuler les solutions d’essai composées à partir de solutions mères dans les 30 minutes précédant l’application expérimentale sur les cellules. 6. Placage des cardiomyocytes (le jour de la mesure de la contractilité) Sortez du réfrigérateur à 4 °C une plaque à huit puits contenant des lamelles recouvertes de pellicule et placez-en une avec précaution dans une chambre d’enregistrement très bien nettoyée (figure 1). Ensuite, remettez la plaque à huit puits au réfrigérateur à 4 °C jusqu’au prochain dressage.REMARQUE : Utilisez une lingette non pelucheuse (Table des matériaux) pour essuyer la lamelle enduite tout en gardant la lamelle recouverte d’une fine couche de laminine. Assurez-vous également de jeter les lamelles usagées dans un contenant pour objets tranchants. Ensuite, prenez un flacon de cellules (étape 3.2) et aspirez la solution B du flacon pour atteindre un volume aussi petit que possible sans perdre de cellules (~200 μL). Ensuite, distribuez les 200 μL de cellules dans la chambre du microscope enregistreur montée sur la platine d’un microscope inversé (Table des matériaux). Laissez les alvéoles se déposer sur la lamelle pendant 5 min. En attendant que les cellules se stabilisent complètement, ouvrez le champ de vision du microscope et déterminez si la densité cellulaire est adéquate (~70 %) pour le début de l’essai.REMARQUE : Assurez-vous que l’aspiration n’aspire pas toutes les cellules si plus de 200 μL sont distribués. 7. Enregistrement de la contractilité des cardiomyocytes Une fois le placage terminé, équilibrez les cellules pendant 5 min en les perfusant continuellement avec la solution C à l’aide du système de perfusion sous pression (tableau des matériaux). Ajustez correctement l’aspiration, allumez le boîtier de contrôle de la température et la plaque chauffante et réglez-les pour qu’ils fournissent ~35 °C. Ensuite, stimulez les cellules avec une tension au-dessus du seuil à une fréquence de stimulation de 1 Hz (impulsion bipolaire d’une durée de 3 ms) sur un stimulateur de champ avec une paire de fils de platine placés sur les côtés opposés de la chambre connectés à un stimulateur de champ. Réglez l’amplitude de l’impulsion stimulante à 1 V, puis augmentez-la jusqu’à ce que les cardiomyocytes commencent à générer des cycles de contraction-relaxation. Utilisez une valeur de seuil de 1,5x tout au long de l’expérience.REMARQUE : Sélectionnez des cellules saines avec une morphologie en forme de bâtonnet et des stries claires. Ensuite, ajustez le champ de vision et concentrez-vous sur le fait d’afficher autant de cellules en contraction que possible (Figure 2A). Ensuite, affichez les images numérisées des cellules dans le logiciel d’acquisition du système d’enregistrement de la contractilité optique. Ce logiciel utilise une caméra haute résolution à fréquence d’images élevée avec une fréquence d’images de 150 FPS (Table of Materials, Figure 1) pour enregistrer un flux vidéo contenant plusieurs myocytes dans la même image.REMARQUE : Cela fournit une résolution temporelle et spatiale suffisante pour capturer et mesurer la dynamique du sarcomère de plusieurs myocytes sains simultanément. Des processeurs modernes à grand nombre de cœurs sont utilisés pour permettre le calcul parallèle des changements de longueur du sarcomère à partir du flux vidéo en temps réel (les données de densité optique sont collectées à partir de régions d’intérêt définies par l’utilisateur [ROI] placées sur les images de cardiomyocytes sains et parallèles à l’axe de contraction, Figure 2B). Les données d’intensité optique montrent des bandes claires et sombres correspondant aux raies Z des cardiomyocytes (Figure 1, Figure 2C). Enfin, ces données sont affichées à l’utilisateur à des fins de surveillance et enregistrées sur un disque pour une analyse ultérieure (Figure 2C).Évitez les zones des cellules qui ne sont pas nettes. De plus, ne placez pas les ROI près du bord des cellules, car les changements dans la contraction des cellules pendant l’application des médicaments peuvent empêcher les ROI de lire la contraction des cellules. Lorsque la sélection des ROI est terminée et que les contractions répondent aux normes d’utilisation nécessaires (p. ex., raccourcissement du sarcomère >1 % ; contraction rythmique lors de l’application d’une fréquence de stimulation de 1 Hz, absence d’événements arythmiques), commencer l’expérience pour évaluer les effets d’un composé. Le protocole de stimulation et la séquence d’application des concentrations d’essai du composé sont présentés dans le tableau 1. Le logiciel d’acquisition gérera, de manière automatisée, l’acquisition et l’affichage des données et l’étiquetage des concentrations d’essai et de la durée du traitement.NOTA : Appliquer les concentrations d’essai si la contraction reste à une amplitude stable pendant toute la période de référence du véhicule. Disqualifiez les cellules affichant une liste ascendante ou descendante. Assurez-vous également que la perfusion est commutée sur les différentes concentrations d’essai tout au long de l’expérience. Une fois l’expérience terminée et le stockage des données sur le serveur, éteignez la perfusion et le chauffage, arrêtez la stimulation, nettoyez la chambre du microscope avec de l’eau distillée, puis retirez la lamelle en verre et séchez soigneusement la chambre.REMARQUE : Nettoyez soigneusement la chambre car cela est essentiel pour éviter d’exposer prématurément le prochain ensemble de cellules à un composé, invalidant ainsi toutes les données collectées. Ensuite, effectuez un nouveau placage de cardiomyocytes et effectuez une expérience supplémentaire pour obtenir suffisamment de données pour terminer le test du composé ou tester un nouveau composé. 8. Arrêt du système d’enregistrement de la contractilité optique Lorsque les tests quotidiens du ou des composés sont terminés, éteignez d’abord tous les équipements qui ne sont pas nécessaires pour nettoyer le système et copiez les données pour une analyse hors ligne. Ensuite, retirez les flacons en verre de 100 mL (tableau des matériaux) contenant les solutions des concentrations d’essai finales et remplacez-les par des flacons en verre remplis à moitié de solution concentrée RBS 25 (tableau des matériaux). Perfusez la solution RBS à travers la chambre du microscope pendant 5 minutes, puis débranchez la tubulure de perfusion de la chambre, nettoyez-la avec de l’eau distillée et enfin, séchez-la soigneusement.REMARQUE : Assurez-vous que l’aspirateur fonctionne bien pour éviter toute inondation possible. Ensuite, connectez la tubulure de perfusion à la tubulure de drainage. À l’aide du logiciel du système de perfusion sous pression (Table of Materials), faites fonctionner la solution RBS pendant 10 min tout en vous assurant que la pression et le débit sont correctement réglés. Ensuite, perfusez du DMSO à 1 % pendant 5 min, puis de l’eau distillée pendant 15 à 20 min pour terminer le nettoyage du système de perfusion. Éteignez la lumière du microscope et mettez son couvercle. Ensuite, débranchez les fils de la caméra du boîtier sur le côté du microscope et éteignez le ventilateur. Assurez-vous que toutes les bouteilles usagées sont envoyées pour le nettoyage et l’autoclave. Enfin, assurez-vous que tous les seaux de drainage sont remplis au 1/4 ou moins.REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a suffisamment de lamelles enduites de laminin pour une utilisation le lendemain. Enfin, copiez les fichiers dans le dossier d’acquisition de toutes les expériences effectuées sur chaque système d’enregistrement et collez-les dans un serveur de sauvegarde sécurisé pour une analyse hors ligne supplémentaire. Ensuite, supprimez tous les fichiers de données du dossier d’acquisition. 9. Analyse des données de contractilité Effectuez une analyse hors ligne à l’aide du logiciel d’analyse et d’une macro personnalisée pour faire la moyenne des données. Le logiciel d’analyse calcule et rapporte diverses mesures à partir des données de dynamique du sarcomère produites par le logiciel d’acquisition. Une liste détaillée de ces paramètres est fournie à la figure 2D.REMARQUE : L’application de techniques logicielles de bas niveau permet d’analyser de nombreux cycles d’enregistrements en 5 s. Le principal paramètre permettant d’évaluer les modifications de la contractilité induites par les médicaments est l’amplitude de la contractilité (% de raccourcissement du sarcomère = variation de la longueur du sarcomère). Elle est calculée comme la longueur du sarcomère au pic de contraction/longueur du sarcomère au repos et la moyenne sur les 20 derniers transitoires de contractilité pour chaque concentration d’essai. Quantifier les effets du composé d’essai sur l’amplitude moyenne de la contractilité par rapport à la condition de contrôle de base spécifique du véhicule de chaque cardiomyocyte. Exprimez les résultats moyens sous forme de moyenne ± MEB et produisez un graphique représentant l’effet de la concentration du composé d’essai sur l’amplitude de la contractilité. Ensuite, ajustez la courbe concentration-réponse à l’équation de Hill à l’aide d’un logiciel d’analyse (Table des matériaux) pour dériver les valeurs IC50 (concentration produisant une inhibition de 50 % de l’amplitude de la contractilité) et EC50 (concentration produisant une augmentation de 50 % de l’amplitude de la contractilité). En plus de l’amplitude de contractilité, vous pouvez également calculer d’autres paramètres :Post-contraction : Identifiez la post-contraction comme une contraction secondaire spontanée transitoire du cardiomyocyte qui se produit avant la prochaine contraction régulière et produit une contraction anormale et non synchronisée. Échec de la contraction : Identifiez l’échec de la contraction comme l’incapacité du stimulus électrique à induire une contraction. Variabilité à court terme (VUT) et alternan : Visualisez ces deux paramètres dans des diagrammes de Poincaré de la variabilité de l’amplitude de contraction.Calculer le VUT (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) avec les 20 derniers transitoires de chaque période de concentration de l’objet témoin et de l’article d’essai. Identifier les alternances comme des transitoires d’amplitude de contractilité alternée courte et longue répétitive. Pour calculer l’incidence de la pro-arythmie, normalisez les valeurs STV à la valeur de contrôle du véhicule de chaque cellule, tracez la postcontraction, l’échec de contraction, le STV et les alternants, et exprimez-les en % de l’incidence des cellules présentant chacun des signaux. Complétez le profilage mécanistique multiparamétrique avec le calcul du temps Ato pic, de la désintégration jusqu’à 30 % de relaxation (Decay 30), de la désintégration jusqu’à 90 % de relaxation (Decay 90), du temps jusqu’à 90 % de relaxation (TR90) (Figure 2D), de la longueur du sarcomère de base, du temps jusqu’à 50 % du pic, de la hauteur du pic, de la longueur du sarcomère à la contractilité maximale, de la vitesse de contraction maximale et de la vitesse de relaxation maximale12. Comme pour l’amplitude de la contractilité, exprimez ces paramètres par rapport à la condition de contrôle de base spécifique de chaque cardiomyocyte et représentez-les graphiquement dans des diagrammes concentration-réponse.