安全性薬理学の予測性を高めるための微小電極アレイ上の心筋細胞のレーザー誘起活動電位様測定

培養心筋細胞からの電気的活動を記録するために使用される記録システムは、ヒーターとコンピューターに取り付けられたカルボゲン用のチャンバーを備えた標準的なMEAシステムから構成されていました。このシステムは細胞内記録装置の上に置かれ、細胞内記録装置は小型の防振ユニットの上に取り付けられました(図1A-B)。 iPS細胞由来心筋細胞2は、融解後2〜3日以内(in vitro、DIV)に自発的に拍動を開始し、顕微鏡下で観察した。DIV 4以降、拍動周波数は規則的になり、MEAチップの各ウェル内のほとんどの電極で、脱分極成分のピークtoピーク振幅が1〜5 mVの細胞外電界電位(FP)を検出できました。電気的活動は、調査中の井戸の95%以上で検出できました。DIV 7以降、細胞剥離の可能性が高まり、これらのウェルのさらなる使用が不可能になりました。 レーザー誘起膜開口部を制御するソフトウェアにより、細胞膜の開口部を介するレーザーの出力とプロセス時間の両方を調査中の電極上でのみ調整できますが(図1C)、それぞれのウェル内の他の電極は影響を受けません。設定が保守的すぎてもFPの波形は変化しませんでしたが、設定が高すぎると心筋細胞の推定損傷が発生し、激しいが一時的な拍動または信号の喪失によって示されます。セルによって十分に許容される40%のパワーおよび25%のプロセス時間の設定に調整された場合、レーザパルスのトリガは、記録された波形に複数の変化をもたらした(例示的な記録については 図1D を参照されたい)。これらの条件下では、電極材料の変質は肉眼的に観察されなかった。記録された信号振幅は、ランダムに選択された記録のサブセットから分析され、4.1±0.41(n = 20、範囲1.34〜8.83)倍と大幅に増加し、7〜22mVの振幅をもたらしました。さらに、波形は、最初に急速、二相性、および過渡的な電圧偏向を伴う標準的なFP形状から、ベースラインでプラトー位相が戻り、FPの終わりを示す小さなたわみが、急速な上昇、拡張された脱分極プラトー相、およびベースラインを下回るアンダーシュートを伴う再分極相を伴う細胞内に記録されたAPに近い形状に変換されました(図1E).これらの電圧たわみをレーザー誘起AP(liAP)と定義しました。ほとんどの場合、遷移は一時的であり、少なくとも部分的に5分以内に反転しました。心臓合胞体内の信号伝播は、liAP誘導後も変化せず(図2)、残りの合胞体がレーザーパルスによる潜在的な損傷の影響を受けなかったことを示しています。 細胞内に記録されたAPとの類似性は、FPがアクセスできないliAPのパラメータを抽出することを可能にし(例示的なパラメータについては、例えば、図 3Aを参照されたい)、最も顕著なのは、特定の時点(例えば、20%、50%、および90%)におけるliAPの持続時間の測定であり(図3B)、APの説明に一般的に使用されるAPD20/50/90に類似している。 次に、一般的に使用される心臓活性薬理学的ツール化合物に対するレーザー開口心筋細胞の応答をテストしました。例示的なプロトコル設計を 図3Cに見出すことができる。liAPの形質転換は実験全体を通して常に持続するとは限らなかったため、化合物の塗布は、総記録時間を短縮するために累積的な方法ではなく、ウェルあたりの単一濃度として実行されました。それにもかかわらず、試験化合物を適用する前に、セルを再度開くか、別の電極領域を開く必要がありました。 特定のL型Ca2+チャネル遮断薬であるニフェジピン23,24を添加すると、濃度依存的にliAPのプラトー相が減少し、それによってliAP全体が短縮されました(図4A、B)。この短縮は、操作されていない電極からの心筋細胞のFPから得られた分析に匹敵し(図4C)、この記録方法は古典的なFP記録と比較して悪影響を及ぼさないことを示しています。 E4031は、関連するKv1.11(hERG)カリウムチャネル25の再分極を阻害し、増加した濃度で心筋細胞の不整脈挙動を引き起こします。FP記録から得られた分析と同様に、E4031は濃度依存的にliAP持続時間を増加させました(図5)。さらに、0.01μM以上の濃度では、liAPの端に小さな正の電圧たわみが見られました。これらのたわみは濃度が高いほど顕著になり、これらのたわみがほとんど見えないFPとは異なり、一時的な新しい脱分極を示しています(図5B-C、上部(FP)と下部(liAP)のトレースを参照)。この動作は、早期後分極(EAD)として知られています。0.1μMの最高濃度では、これらのEADは時間の経過とともに、早期の活動電位である異所性拍動にエスカレートしました(図5C)。EADと異所性拍動の両方が不整脈活動の重要な指標です。図5Dに示す例の終わりに、電気的活動は不整脈拍動をもたらした。また、FP記録とliAP記録の間に表示された濃度-応答-関係は一致していました(図5E)。ただし、高濃度の試験化合物でのFPの再分極成分が弱いことに起因するFPデータには、より大きなばらつきがあります。iPS細胞由来心筋細胞2の特徴は、制御条件下でも非生理学的に長いAPsを生成する傾向があること(AP持続時間>700ms)であると思われる。MEAシステムは、固有の0.1Hz ACフィルタリングを適用し、その結果、基礎となるAPの開始と終了に関する定性的情報を遮ることなく、部分的にフィルタリングされた形状のLiAPが得られました。 その結果、不整脈電圧たわみの初期発生は、FP記録と比較して、liAPの低濃度で検出できることが判明しました。 図6 に示されているのは、3μMの濃度でのドフェチリドの適用中の電気的活動の記録である。記録は同じウェルで得られた。FPとliAPはどちらも約2秒の持続時間を示しましたが、FP波形は目立たず、規則的な再偏光偏向を示しました。同時に、LiAPの終わりに、さまざまな大きさのEADが表示されるようになりました。関連する安全性-薬理学的感受性のこの増加は、表面プラズモン共鳴によって誘導されるliAPが再分極相の適格性を改善し、それによって研究中の試験化合物の作用機序についてさらに学ぶのに役立つという発見をさらに裏付けています。 図1:細胞内記録のセットアップおよび例示的な記録 。 (A)セットアップの概要。(B)オープンMEA記録アンプを備えた記録システムの上面図。(C)右側に仮想MEAマップを持つ初期化ソフトウェア。1:防振テーブル、2:細胞内記録システム、3:レーザー保護蓋、4:加湿カルボゲンチャンバー、5:MEA加熱システム、6:MEAインターフェースボード、7:記録アンプ内の1ウェルMEAチップ。(D)LiAPの誘導前後の1つの電極からの記録例。上:約6分の録画点線は、下部に表示される展開領域を示します。(E) 拡大FP (上) と liAP (下) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:信号伝搬パターンはLiAP誘導後も保存されています。 シンシチウム内の励起波の信号伝搬の偽色分け。青は早期(-4ミリ秒から開始)を示します。赤色は、カラーバーで示されているように、参照電極E54で得られた信号からの遅い時間ポイント(+3ms)を示す。信号は電極アレイの右上から左下に移動します。(A)liAP誘導前、(B)liAP誘導の1分後。(C)LiAP誘導の4分後。フラッシュ記号は、電極64におけるレーザ誘導点を示す。全体的な伝搬方向の違いは見られないことに注意してください。黒い四角形は無効なデータを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:FP/liAPパラメータの定義と記録プロトコル (A)古典的なFPから抽出できるパラメータ。 (B)liAPから取得できる追加のパラメータ。(C)薬物測定のタイムライン。左から右へ:60秒間の制御記録、liAPの誘導、60秒間のliAPの記録、薬物塗布、洗浄時間300秒、liAPの再誘導、60秒間のliAPの記録。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:ニフェジピンは濃度依存的に心臓LiAPを短縮 します。 (A)上:コントロール(青)および0.3 μMニフェジピン存在下(赤)でのFPトレース。トレースは、わかりやすくするために Y 軸オフセットで表示されます。下:同じMEA録音からのliAPトレースにより、ビートレートの増加と相まってliAPが短縮されます。(B)対照中の単一LiAPの重ね合わせ(青)および異なる濃度のニフェジピンの適用(赤)。a: 0.01 μM, b: 0.1 μM, c: 0.3 μM. 濃度が上がるにつれてLiAP持続時間が短くなることに注意してください。(C) FP(黒)とliAP(赤)の記録から得られた信号幅の濃度応答関係。データはn=3実験からのものであり、対照に対して正規化したものである。エラーバーは平均の標準誤差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:E4031は(プロ)不整脈行動を誘発する。 (A)制御条件におけるFP(上)およびliAP(下)。(B-C)FPとliAPは、E4031(0.1μM)を適用した後、異なる時点で記録されました。80秒後、最初のEADがLiAPの最後に表示されます(B、赤い矢印でマークされています)。EADは、試験化合物(C)の存在下で320秒後に異所性拍動に変換されます。(D)530秒後、心臓合胞体は頻脈状態に入ります。liAP録音から描かれたトレース。(E) FP(黒)とliAP(赤)幅の濃度応答関係。n=4実験からのデータを、対照に正規化した。エラーバーは平均の標準誤差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:不整脈イベントの検出は、FPよりもliAPの方が感度が高い 。 (A)FP記録と(B)3μMドフェチリドの施用中の同じウェル内でのliAP記録。一部のLiAPの最後にはEADは検出可能ですが、FP記録では検出できません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。