JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

تصور الديناميكيات التوافقية لمستقبلات الغشاء باستخدام FRET أحادي الجزيء

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/64254
, ,
1Department of Molecular Biosciences,Northwestern University

Summary

تقدم هذه الدراسة إجراء مفصلا لإجراء تجارب نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) على مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) باستخدام وضع العلامات الخاصة بالموقع عن طريق دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA). يوفر البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لإعداد عينة smFRET والتجارب وتحليل البيانات.

Abstract

تعد قدرة الخلايا على الاستجابة للإشارات الخارجية ضرورية لتطوير الخلايا ونموها وبقائها. للاستجابة لإشارة من البيئة ، يجب أن تكون الخلية قادرة على التعرف عليها ومعالجتها. تعتمد هذه المهمة بشكل أساسي على وظيفة مستقبلات الغشاء ، التي يتمثل دورها في تحويل الإشارات إلى اللغة الكيميائية الحيوية للخلية. تشكل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من بروتينات مستقبلات الغشاء في البشر. من بين GPCRs ، مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي فئة فرعية فريدة تعمل كدايمرات ملزمة وتمتلك مجالا كبيرا خارج الخلية يحتوي على موقع ربط الليغاند. أدت التطورات الحديثة في الدراسات الهيكلية ل mGluRs إلى تحسين فهم عملية تنشيطها. ومع ذلك ، فإن انتشار التغيرات التوافقية واسعة النطاق من خلال mGluRs أثناء التنشيط والتشكيل غير مفهوم بشكل جيد. يعد نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) تقنية قوية لتصور وقياس الديناميكيات الهيكلية للجزيئات الحيوية على مستوى البروتين الواحد. لتصور العملية الديناميكية لتنشيط mGluR2 ، تم تطوير أجهزة استشعار مطابقة فلورية تعتمد على دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) التي سمحت بوضع علامات على البروتين الخاص بالموقع دون إزعاج البنية الأصلية للمستقبلات. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية إجراء هذه التجارب ، بما في ذلك نهج وضع العلامات UAA الجديد ، وإعداد العينات ، والحصول على بيانات smFRET وتحليلها. هذه الاستراتيجيات قابلة للتعميم ويمكن توسيعها للتحقيق في الديناميكيات التوافقية لمجموعة متنوعة من بروتينات الغشاء.

Introduction

يعتمد نقل المعلومات عبر غشاء البلازما بشكل كبير على وظيفة مستقبلات الغشاء1. يؤدي ارتباط الرباط بالمستقبل إلى تغيير مطابق وتنشيط المستقبلات. غالبا ما تكون هذه العملية ألوستيريك في طبيعتها2. مع أكثر من 800 عضو ، تعد المستقبلات المرتبطة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من مستقبلات الغشاء في البشر3. نظرا لدورها في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، أصبحت GPCRs أهدافا مهمة للتطوير العلاجي. في النموذج الأساسي لإشارات GPCR ، يؤدي تنشيط ناهض إلى تغييرات تطابقية للمستقبل الذي ينشط لاحقا مركب بروتين G غير المتجانس عن طريق تبادل الناتج المحلي الإجمالي مقابل GTP في جيب ربط النيوكليوتيدات في Gα. ثم تتحكم الوحدات الفرعية G α-GTP و Gβγ المنشطة في نشاط البروتينات المستجيبة في اتجاه المصب وتنشر سلسلة الإشارات 4,5. تعتمد عملية الإشارة هذه بشكل أساسي على قدرة الأربطة على تغيير الشكل ثلاثي الأبعاد للمستقبل. إن الفهم الميكانيكي لكيفية تحقيق الليغاند لذلك أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة وتصميم مستقبلات وأجهزة استشعار اصطناعية.

مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي أعضاء في عائلة GPCR من الفئة C وهي مهمة للتأثيرات العصبية البطيئة للغلوتامات وضبط استثارة الخلايا العصبية 6,7. من بين جميع GPCRs ، تعد GPCRs من الفئة C فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية من حيث أنها تعمل كدايمرات ملزمة. يحتوي mGluRs على ثلاثة مجالات هيكلية: مجال مصيدة ذبابة الزهرة (VFT) ، والمجال الغني بالسيستين (CRD) ، والمجال عبر الغشاء (TMD)8. التغييرات التوافقية أثناء عملية التنشيط معقدة وتشمل اقتران التشكيل المحلي والعالمي الذي ينتشر على مسافة 12 نانومتر ، فضلا عن التعاون الخافت. التشكيلات الوسيطة ، والترتيب الزمني للدول ، ومعدل الانتقال بين الدول غير معروفة. من خلال اتباع تشكيل المستقبلات الفردية في الوقت الفعلي ، من الممكن تحديد الحالات الوسيطة العابرة وتسلسل التغيرات التوافقية أثناء التنشيط. يمكن تحقيق ذلك من خلال تطبيق نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء 9,10 (smFRET) ، كما تم تطبيقه مؤخرا لتصور انتشار التغيرات التوافقية أثناء تنشيط mGluR2 11. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في تجارب FRET في توليد مستشعرات FRET عن طريق الإدخال الخاص بالموقع للفلوروفورات المانحة والمتقبلة في البروتين محل الاهتمام. تم اعتماد استراتيجية دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) 12،13،14،15 للتغلب على قيود تقنيات وضع العلامات الفلورية النموذجية الخاصة بالموقع والتي تتطلب إنشاء طفرات أقل من السيستين أو إدخال علامة كبيرة مشفرة وراثيا. وقد سمح ذلك بإعادة الترتيب التوافقي للوصلة الألوستيرية المدمجة الأساسية ، والتي انضمت إلى مجالات ربط الليغاند والإشارات في mGluR2. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم دليل خطوة بخطوة لإجراء تجارب smFRET على mGluR2 ، بما في ذلك نهج وضع العلامات الخاصة بالموقع على mGluR2 مع UAA لربط الفلوروفورات باستخدام تفاعل تسيكل الأزيد المحفز بالنحاس. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول منهجية الالتقاط المباشر لبروتينات الغشاء وتحليل البيانات. البروتوكول الموضح هنا ينطبق أيضا على دراسة الديناميكيات التوافقية لبروتينات الغشاء الأخرى.

Protocol

ويرد وصف لسير العمل العام للبروتوكول في الشكل 1. 1. إعداد غرفة العينة تنظيف الانزلاق والغطاءملاحظة: تهدف هذه الخطوات إلى تنظيف أسطح الشرائح وكذلك الأغطية وإعدادها للأمينوسيلان. أحد المتطلبات الحاسمة لإجراء تجارب التألق أحادية الجزيء على جزيئات مر?…

Representative Results

التعبير ووضع العلامات الفلورية لمستشعر FRET القائم على UAAهنا ، تتم مناقشة النتائج النموذجية لإدراج ووضع العلامات الفلورية على UAA (AZP) داخل CRD من mGluR2 (548UAA)11. كما ذكرنا سابقا ، لإدراج AZP في mGluR2 ، من الضروري التعبير المشترك عن الآلات الانتقالية الهندسية ، والتي تتضمن تركيب …

Discussion

GPCRs هي بروتينات تعمل على غشاء الخلية لبدء نقل الإشارة. ويتألف العديد من المحافل العالمية للإبلاغ من مجالات متعددة، وتعتمد الإشارات على التفاعل التعاوني بين المجالات. لتعديل خصائص مستقبلات الغشاء هذه ، من الضروري فهم السلوك الديناميكي للمجالات المتعددة. نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجز…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر رضا فابابخش على المناقشات. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01GM140272 (إلى R.V.) ، وصندوق سيرل للقيادة لعلوم الحياة في جامعة نورث وسترن ، ومن قبل اتحاد شيكاغو الطبي الحيوي بدعم من صناديق سيرل في صندوق شيكاغو المجتمعي (إلى R.V). تم دعم B.W.L. من قبل منحة التدريب T32GM-008061 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS).

Materials

(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -. l., Wang, Y., Li, D. -. l., Luo, J., Liu, M. -. Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -. H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I., Pecoraro, V. Chapter Four – Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. 580, 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -. M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -. H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Single-molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMGluR2HEK 293T CellsPEGylationAmino SalinizationDremelAcetonePotassium HydroxideMethanolPoly-L/D-lysineTransfectionAlkyne Cyanine Dyes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Banerjee, C., Liauw, B. W., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image