高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

細胞膜は非常に混雑した複雑なシステム^です1。分子クラウディングは、タンパク質や脂質などの膜結合エンティティの拡散に大きな影響を与える可能性があります^2,3,4。同様に、受容体二量体化や膜複合体のオリゴマー化のような脂質膜上の二分子反応は、クラウディングの影響を受けます^5,6,7。クラウダーの性質、配置、および濃度は、いくつかの方法で膜結合、拡散性、およびタンパク質間相互作用を制御することができます^8,9。細胞膜上の膜クラウディングを制御し、埋め込まれた生体分子への影響を解釈することは困難であるため、研究者は代替のin vitroシステムを確立しようと試みてきました¹⁰。

人工混雑膜の一般的なアプローチは、二重膜にポリマー(ポリエチレングリコール、PEGなど)グラフト脂質をドープすることです^11,12。支持された脂質二重層(SLB)上のタンパク質と脂質のダイナミクスを視覚化する際に、これらのポリマーは、二重層を下にある支持体から効果的に持ち上げることにより、膜に埋め込まれた成分を下にある負に帯電した基板(ガラスなど)からさらに保護します。ポリマーのサイズおよび濃度を変化させることによって、分子クラウディングの程度、ならびに下にある固体支持体からのその分離を制御することができる^13、14。これは明らかに、膜貫通生体分子がその活性を失う可能性があるポリマークッション^15,16のない固体基質上に支持された脂質二重層よりも有利である17,18,19。さらに重要なことに、それは私たちが多くの膜プロセスにとって重要であるin vitroで細胞膜の混雑した環境を再現することを可能にします。

膜上に表面グラフトされたポリマーも、そのグラフト密度に応じてそれらの配置の変化を受ける¹²。低濃度では、それらは膜表面の上にキノコとして知られるエントロピーコイル状の配置のままである。濃度が増加するにつれて、それらは相互作用し始め、ほどけて伸びる傾向があり、最終的に膜²¹上に緻密なブラシ様の形成をもたらす。キノコからブラシレジームへの移行は非常に不均一であり、ポリマーの特性が不十分な条件で現れるため、ポリマーグラフト膜上の混雑には十分に特徴付けられた条件を使用することが重要です。最近の研究²⁰と比較して、膜貫通生体分子の拡散輸送と活性を維持する混雑した膜組成を特定し、報告しています。

このプロトコルでは、PEG化脂質膜を生成する方法について説明し、ポリマー配置の2つの異なるレジーム(つまり、キノコとブラシ)での混雑を模倣するPEG密度の推奨事項を提供します。このプロトコルでは、これらの混雑した膜に埋め込まれた分子の単一分子結合、粒子追跡、および光退色データの取得と分析についても説明します。まず、徹底的な洗浄手順、イメージングチャンバーの組み立て、およびPEG-SLBの生成について説明します。次に、単一分子結合、粒子追跡、および光退色実験の詳細を提供します。第三に、i)相対的な結合親和性の抽出、ii)分子拡散の特徴付け、およびiii)膜上の単一分子の動画からのタンパク質集合体のサブユニットのカウントについて説明します。

このシステムを単一分子イメージングで特徴付けましたが、このプロトコルは、脂質膜に対する生体分子反応に対するクラウディングの影響を理解することに関心のあるすべての膜生物物理学者にとって有用です。全体として、混雑して支持された脂質二重層を作成するための堅牢なパイプラインと、それらに対して実施されるさまざまな単一分子アッセイ、および対応する分析ルーチンを紹介します。