Kranievinduer er blevet allestedsnærværende brugt inden for neurovidenskab, neural teknik og biologi for at muliggøre direkte visualisering og billeddannelse af cortex hos levende dyr 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Den kraftfulde kombination af transgene mus og multifotonbilleddannelse har givet ekstremt værdifuld indsigt i kredsløbsaktivitet og anden biologisk indsigt i in vivo-hjernen 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturemikroskoper monteret på kraniet har yderligere udvidet disse muligheder for at muliggøre optagelser i vågne, frit bevægelige dyr¹⁹. Processen med at skabe et kranievindue kræver powerboring for at tynde eller helt fjerne kraniebenet for at producere store nok kraniotomier til at sikre et gennemsigtigt stykke glas over cortex²⁰. Polydimethylsiloxan (PDMS) og andre polymerer er også blevet testet som kranievinduesmaterialer ^9,21. I sidste ende er det ideelle kranievindue et, der ikke ændrer eller forstyrrer normal endogen aktivitet nedenunder. Det er imidlertid almindeligt accepteret, at kranial vinduesboring forværrer underliggende væv, hvilket fører til skade på hjernen, forstyrrelse af miljøet og påvirker meninges til det punkt, hvor multifotonbilleddannelse falder²². Den resulterende neuroinflammation har en bred vifte af virkninger, der spænder fra permeabilitet af blod-hjerne-barrieren (BBB) til aktivering og rekruttering af gliaceller omkring implantatstedet²³. Derfor er karakterisering af sikrere og mere reproducerbare kranievinduesboremetoder afgørende for ensartet billedkvalitet og reduktion af forstyrrende faktorer.

Mens man sørger for at minimere traumer i det underliggende væv, har handlingen med at bore knoglen potentialet til at forårsage både termiske og mekaniske forstyrrelser i hjernen^24,25. Mekanisk traume fra utilsigtet borindtrængning i dura kan yderligere fremkalde varierende grader af kortikal skade²⁴. I en undersøgelse af Shoffstall et al.25 resulterede varmen fra knogleboring i en øget BBB-permeabilitet, som indikeret af tilstedeværelsen af Evans Blue (EB) farvestof i hjernens parenchyma²⁵. EB-farvestof, injiceret intravenøst, binder sig til cirkulerende albumin i blodbanen og krydser derfor normalt ikke en sund BBB i mærkbare koncentrationer. Som et resultat anvendes EB-farvestof almindeligvis som en følsom markør for BBB-permeabilitet^26,27. Mens deres undersøgelse ikke direkte målte virkningen af BBB-permeabiliteten på efterfølgende biologiske følgevirkninger, der blev undersøgt, har tidligere undersøgelser korreleret BBB-permeabilitet med et øget neuroinflammatorisk respons på kronisk implanterede mikroelektroder og ændringer i motorisk funktion²⁸.

Afhængigt af undersøgelsens mål kan størrelsen af termisk og mekanisk skade bidrage til en kilde til eksperimentel fejl, hvilket negativt påvirker undersøgelsens strenghed og reproducerbarhed. Der er snesevis af citerede metoder til fremstilling af kranievinduer, hver ved hjælp af forskellige boreudstyr, hastigheder, teknikker og brugere 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 rapporterede, at den observerede variation i opvarmningsresultaterne blev tilskrevet variabilitet i borets påførte kraft, tilførselshastighed og anvendelsesvinkel, blandt andre aspekter, der ikke kan kontrolleres for ved boring med^{hånden 25}. Der er en tro på, at automatiserede boresystemer og andet stereotaksisk udstyr kan forbedre reproducerbarheden og udfaldskonsistensen, men offentliggjorte metodestudier har ikke nøje evalueret temperatur eller BBB-permeabilitet som et af resultaterne. Derfor er der behov for mere reproducerbare og konsekvent anvendte metoder til fremstilling af kranievinduer samt metoder, der anvendes strengt til at vurdere virkningen af kranievinduesboring på underliggende neuralt væv.

Fokus for denne undersøgelse er at bestemme og udvikle konsistente og sikre boremetoder til kranievinduer. Størrelsen af kraniotomien til kranial vinduesinstallation er signifikant større end standard kraniotomier til hjerneimplanterede mikroelektroder. Sådanne kraniotomier kan ikke udfyldes med et enkelt burrhul, når der anvendes standardudstyr, hvorved der indføres mere interkirurgisk teknikvariation, når den udføres med hånd²⁰. Kirurgiske borerobotter er blevet introduceret til feltet, men er ikke blevet bredt vedtaget ^1,6,29. Automatisering af boring giver kontrol over variabler, der bidrager til observeret variation fra forsøg til forsøg, hvilket tyder på, at brugen af udstyret kan reducere inter- og intrakirurgeffekter. Dette er af særlig interesse i betragtning af den ekstra vanskelighed ved den større kraniotomi, der er nødvendig for kranial vinduesplacering. Mens man kunne antage, at der var klare fordele ved den kontrol, der leveres ved automatisering af boringen, har der været ringe vurdering af implementeringen af dette udstyr. Selvom der ikke er observeret synlige læsioner⁵, ønskes den højere følsomhedstest med EB.

Her måles BBB-permeabilitet ved hjælp af en kommercielt tilgængelig kirurgisk borerobot med tilsvarende software, som giver mulighed for programmering af stereotaksiske koordinater, kraniotomiplanlægning/kortlægning og et udvalg af borestilarter (“punkt-for-punkt” vs “vandret”), der henviser til borets rutebane. Indledningsvis bores otte “frø” -punkter (figur 1A), der skitserer kranievinduet. Herfra skæres mellemrummet mellem frøene ud ved hjælp af enten “punkt-for-punkt” eller “vandret” boremetode. “Point-by-point” udfører lodrette pilothulskæringer (svarende til en CNC-borepresse), mens “vandret” udfører vandrette snit langs omkredsen af kranievinduet, der skitserer hullet (svarende til en CNC-router). Resultatet for begge metoder er et stykke kranium, der kan fjernes for at afsløre kranievinduet. For at isolere skader fra boring fjernes kranievinduet ikke fysisk for at undgå yderligere skader. En kombination af EB-farvestof kombineret med fluorescerende billeddannelse bruges til at måle BBB-permeabilitet efter udførelse af kraniotomier hos mus, og et indsat termoelement bruges til direkte at måle temperaturen på hjerneoverfladen under boring (figur 1B, C). Tidligere observationer indikerede, at pulserende boring til/fra med 2 s intervaller var tilstrækkelig til at afbøde boreopvarmning²⁵ og derfor er indarbejdet i den eksperimentelle tilgang til den kirurgiske robot.

Formålet med det præsenterede arbejde er at demonstrere metoder til vurdering af termiske skader fra kraniotomiboring. Mens metoderne præsenteres i forbindelse med automatiseret boring, kan sådanne metoder også anvendes på manuelle boreordninger. Disse metoder kan anvendes til at validere brugen af udstyr og/eller boresystemer, inden de vedtages som standardprocedure.

Figur 1: Skematisk eksperimentel pipeline. Skematisk demonstration af den proces, dyrene gennemgik til EB-kvantificering efter kraniel vinduesprocedure. (A) Skematisk opsætning af musen med stereotaksisk ramme og kirurgisk robotbor. Et eksempel kranievindue er vist over motorcortex med frøpunkter (grøn) og kantpunkter (blå). (B) Perfusionsopsætningen omfatter injektion af 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i hele dyret for at fjerne blod efterfulgt af ekstraktion af hjernen. (C) Hjernen sættes derefter ind i EB-fluorescerende billeddannelsessystemkammer for at udføre fluorescerende billeddannelse på Evans Blue-farvestoffet. Klik her for at se en større version af denne figur.