Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas

Las interfaces aire-agua cubiertas por películas de surfactante son omnipresentes en la vida diaria. Las inyecciones de agua de surfactante se utilizan para mejorar la recuperación de petróleo de campos agotados y se utilizan como soluciones de fracturación hidráulica para gas y petróleo de esquisto. Las espumas gas-líquido y las emulsiones líquido-líquido son comunes a muchos procesos industriales y científicos como lubricantes y agentes de limpieza y son comunes en los alimentos. Los surfactantes y las proteínas en las interfaces estabilizan las conformaciones de anticuerpos durante el envasado, almacenamiento y administración ^1,2,3,4,5, la estabilidad de la película lagrimal en el ojo ^6,7,8 y la mecánica pulmonar ^{9,10,11,12,13,14}, ¹⁵.

El estudio de los agentes tensioactivos o tensioactivos que se adsorben a las interfaces y sus propiedades tiene una larga historia con muchas técnicas experimentales diferentes ^{16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27} . Un desarrollo reciente es el microtensómetro de presión capilar (CPM), que permite el examen de las propiedades interfaciales en interfaces altamente curvas, a escalas de longitud mucho más pequeñas, mientras que utiliza significativamente menos materiales que otros métodos comunes 9,23,24,25. La microscopía de fluorescencia confocal (CFM) se puede utilizar para estudiar la morfología de lípidos y proteínas en las interfaces aire-agua en la CPM²² o en los canales de Langmuir 20,26,27,28,29. Aquí se han combinado un CPM y un CFM para conectar fenómenos morfológicos con propiedades interfaciales dinámicas y de equilibrio para desarrollar relaciones estructura-función para interfaces biológicas y tecnológicas.

Existen numerosos parámetros de importancia en los sistemas de surfactantes interfaciales accesibles al CPM-CFM. En el CPM, una burbuja de aire de 30-200 μm de diámetro se fija a la punta de un tubo capilar de vidrio. En versiones anteriores del CPM, la diferencia de presión capilar entre el interior y el exterior de la burbuja se controlaba a través de una columna de agua y una bomba de jeringa oscilatoria ^9,30 ; la nueva versión descrita aquí los reemplaza con una bomba microfluídica controlada por computadora de mayor precisión. La tensión superficial (γ) se determina a través de la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir de la caída de presión a través de la interfaz establecida por la bomba, ΔP, y el análisis óptico del radio de curvatura de la burbuja, R. La tensión superficial dinámica de la interfaz se puede determinar con una resolución de tiempo de 10 ms después de la generación de una nueva burbuja en contacto con un líquido a granel que contiene un surfactante soluble. La dinámica de adsorción del surfactante se puede describir mediante la ecuación clásica de Ward-Tordai^10,31 para determinar las propiedades esenciales del surfactante, incluida la difusividad, la cobertura superficial y la relación entre la concentración a granel y la tensión superficial de equilibrio. Una vez que se alcanza una tensión superficial de equilibrio, el área interfacial se puede oscilar para medir el módulo dilatacional, registrando los cambios en la tensión superficial, inducidos por pequeños cambios en el área de superficie de la burbuja, A³². Para interfaces más complejas que desarrollan sus propias estructuras internas como polímeros o proteínas entrelazadas, la tensión superficial, , se sustituye por una tensión superficial más general ^4,33, .

La estabilidad pulmonar durante la respiración puede estar directamente relacionada con el mantenimiento de una tensión superficial baja y un módulo dilatacional alto en la interfaz aire-líquido alveolar ^9,10. Todas las superficies pulmonares internas están revestidas con una película continua de micras de espesor de líquido de revestimiento epitelial para mantener la hidratación del tejido³⁴. Este líquido de revestimiento epitelial es principalmente agua, con sales y varias otras proteínas, enzimas, azúcares y surfactante pulmonar. Como es el caso de cualquier interfaz curva líquido-vapor, se induce una presión capilar con la presión más alta en el interior del alvéolo (o burbuja). Sin embargo, si la tensión superficial fuera constante en todas partes dentro de los pulmones, la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ / R, muestra que los alvéolos más pequeños tendrían una presión interna más alta en relación con los alvéolos más grandes, lo que obligaría a los contenidos de gas de los alvéolos más pequeños a fluir a alvéolos más grandes y de menor presión. Esto se conoce como “Inestabilidad de Laplace”^9,35. El resultado neto es que los alvéolos más pequeños colapsarían y se llenarían de líquido y se volverían difíciles de volver a inflar, lo que haría que parte del pulmón colapsara, y otras partes se inflarían en exceso, los cuales son síntomas típicos del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Sin embargo, en un pulmón que funciona correctamente, la tensión superficial cambia dinámicamente a medida que la interfaz aire-líquido epitelial en el área interfacial del alvéolo se expande y se contrae durante la respiración. Si , o , la presión de Laplace disminuye con el radio decreciente y aumenta con el aumento del radio para eliminar la inestabilidad de Laplace, estabilizando así el pulmón⁹. Por lo tanto, y cómo depende de la frecuencia, la morfología y composición monocapa, y la composición del líquido alveolar pueden ser esenciales para la estabilidad pulmonar. El CPM-CFM también ha proporcionado las primeras demostraciones de los efectos de la curvatura interfacial sobre la adsorción de surfactante²⁵, la morfología monocapa²² y el módulo dilatacional⁹. El pequeño volumen (~1 ml) del reservorio en el CPM permite la rápida introducción, eliminación o intercambio de la fase líquida y minimiza la cantidad requerida de proteínas o surfactantes costosos¹⁰.

El contraste en una imagen CPM-CFM se debe a la distribución de pequeñas fracciones de lípidos o proteínas marcados fluorescentemente en la interfaz^16,27. Las monocapas de surfactante bidimensional a menudo exhiben separación de fase lateral en función de la tensión superficial o la presión superficial, π es la diferencia entre la tensión superficial de una interfaz fluido-fluido limpia, γ₀, y una interfaz cubierta de surfactante, γ. π puede pensarse como la “presión” 2-D causada por las interacciones de las moléculas de surfactante en la interfaz que actúa para reducir la tensión superficial del fluido puro. A bajas presiones superficiales, las monocapas lipídicas están en un estado desorganizado similar al líquido; esto se conoce como la fase de expansión líquida (LE). A medida que aumenta la presión superficial y disminuye el área por molécula lipídica, los lípidos se orientan entre sí y pueden sufrir una transición de fase de primer orden a la fase condensada líquida ordenada (LC) de largo alcance 16,20,27. Las fases LE y LC pueden coexistir a varias presiones superficiales y se pueden visualizar a medida que los lípidos marcados fluorescentemente se excluyen de la fase LC y se segregan a la fase LE. Por lo tanto, la fase LE es brillante y la fase LC es oscura cuando se visualiza con CFM¹⁶.

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos necesarios para construir y operar el microtensómetro combinado de microscopio confocal. Esto permitirá al lector realizar estudios de adsorción, medir la tensión superficial, el comportamiento reológico y examinar la morfología interfacial simultáneamente en una interfaz aire/agua o aceite/agua a escala micrométrica. Esto incluye una discusión sobre cómo tirar, cortar e hidrofobizar los capilares requeridos, instrucciones para usar los modos de control de presión, curvatura y área de superficie, y transferencia interfacial de surfactante insoluble a la interfaz curva del microtensiómetro.