Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

İnsan dokusu koleksiyonu, Washington Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma kimliği: STUDY380 ve CR ID: CR3603) tarafından onaylanmış ve Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı tarafından gerçekleştirilmiştir. Doğum Kusurları Araştırma Laboratuvarı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü’nden 5R24HD000836 numaralı NIH ödülü ile desteklenmiştir. Örnekler rıza gösteren katılımcılardan toplandı ve kimliksizleştirilmiş ve herhangi bir sağlık bilgisi olmadan gönderildi. İnce bağırsak örnekleri, buz gibi soğuk Dulbecco’nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) saklandı ve bir gecede alıcı laboratuvara postalandı. 1. Reaktif hazırlama NOT: Reaktiflerin ve katalog numaralarının listesi için Malzeme Tablosu’na bakın; Önerilen hacimler, aksi belirtilmedikçe 6 delikli bir plaka içindir. Dokularla veya enteroidlerle temas eden tüm plastik eşyaları ve uçları kaplamak için 50 mg BSA tozunu 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 100 μg / mL geniş spektrumlu bir antibiyotik primosin ile çözerek% 0.1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.BSA ile kaplamak için, filtrelenmemiş pipet uçlarını, uçları örtecek kadar BSA’ya sahip 50 mL’lik bir konik tüpe yerleştirin, Petri kabı yüzeyini kaplamak için 1-2 mL BSA ekleyin veya kullanımdan önce oda sıcaklığında en az 20-30 dakika boyunca 15 mL konik tüpleri BSA ile doldurun. 50 mL DPBS’yi 100 μg/mL primosin ve 50 μg/mL gentamisin ile karıştırarak DPBS ortamını hazırlayın. Bu ortamı 2,5 μg / mL amfoterisin ile ve olmadan hazırlayın. 2 mL organoid büyüme ortamı, 100 μg / mL primosin, 10 μM Y27632 ve 2,5 μM CHIR99021’i karıştırarak enteroid büyüme ortamı hazırlayın. Günlük taze medya yapın ve 37 ° C’de bir hücre kültürü inkübatöründe ısıtın.NOT: Y27632 için seyreltme faktörü 1:250’dir. CHIR99021 için, CHIR stok çözeltisini sıcak ortamda 1:100’e ve daha sonra enteroid büyüme ortamında 1:40’a kadar seyrelterek 1:400 seyreltme elde edin. Stok bazal membran matrisine 10 μM Y27632 ve 2,5 μM CHIR99021 ekleyerek bazal membran matris karışımını hazırlayın. 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için 8 mg / mL’lik bir protein konsantrasyonunda toplam 285 μL nihai bazal membran matris karışımı yapın.NOT: Bodrum membran matrisinin sıvı halde kalması için buz gibi soğuk olması gerekir ve daha sıcak sıcaklıklarda katılaşır. Stok bazal membran matrisinin protein konsantrasyonu, denklemi kullanarak 8 mg / mL’lik bir nihai protein konsantrasyonu yapmak için gereken hacmi belirler:Cilt 1 × Konsantrasyon 1 = Cilt 2 × Konsantrasyon 2 PBS’deki ‘lik stok PFA’yı 1:8 oranında seyrelterek %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. Enteroidlerin sabitlenmesi için her bir kuyucuk için 0,5 mL yapın. PBS’ye %5 keçi serumu ve %0,5 Triton X-100 ekleyerek blokaj tamponu hazırlayın. Kuyu başına ilk antikor için 1 mL ve kuyu başına ek antikor için 0,5 mL hazırlayın.NOT: İkincil antikorların konakçısı ile aynı türden serum kullanın Her bir antikor için üretici tarafından önerilen konsantrasyonda bloke edici tamponda seyreltilmiş birincil ve ikincil antikorlar hazırlayın. PBS’de 1 mg/mL stok çözeltisinden 1:200’e kadar seyrelterek 5 μg/mL Dmidino-2-fenilindol (DAPI) hazırlayın. Lekeli enteroidlerin kuyusu başına 0,5 mL yapın. PBS’de% 70 gliserol hazırlayın ve enteroidleri mikroskop slaytlarına monte etmek için 0.5 mL yapın. PBS’deki 25 mg/mL stok çözeltisini 1:5 oranında seyrelterek 5 mg/mL dekstran-FITC (Floresein-İzotiyosiyanat) hazırlayın. Mikroenjeksiyon için 20 μL yapın. PBS’deki LPS tozunu 5 mg / mL’lik bir stok çözeltisine yeniden yapılandırarak lipopolisakkaritler (LPS) ve dekstran-FITC’yi hazırlayın. LPS ve dekstran stok çözeltilerini PBS’de 0.1 mg / mL ve 0.5 mg / mL LPS ve 5 mg / mL dextran-FITC’ye seyreltin. Mikroenjeksiyon için 20 μL yapın. Etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N, N, N’, N’-tetraasetik asit (EGTA), EGTA tozunu damıtılmış suda çözerek ve hidroklorik asit (HCl) kullanarak pH’ı yaklaşık 8’e ayarlayarak 0.2 M’lik bir stok çözeltisi yaparak hazırlayın. Kültür ortamında 1:100 seyreltme yaparak 2 mM’lik bir test konsantrasyonu hazırlayın. 2. Örnek toplama Numuneler alındıktan sonra, numune toplama işleminden sonraki 24 saat içinde epitel hücre izolasyonu ve kaplaması yapın. 3. Tüm örneklerden bazal membran matrisinde intestinal epitel hücre kaplaması NOT: Bu prosedür, Michigan Üniversitesi12,13,14’teki Translasyonel Doku Modelleme Laboratuvarı’ndan modifiye edilmiş protokolleri takip eder. Yüksek Wnt faktörüne sahip büyüme ortamlarının kullanılması, enteroid oluşumu için tutarlı sonuçlar verir. Enteroidler kurulduktan sonra, enteroidleri mikroenjeksiyon için küresel şekillere sürmek için yüksek Wnt faktörüne sahip aynı ortamı kullanın. Bağırsak segmentlerini, amfoterisin ile buz gibi soğuk DPBS ile 60 mm x 15 mm Petri kabına aktarın ve buzda 20 dakika bekletin. Doku ıslanırken, ince bağırsağın bölgelerini (duodenum, jejunum veya ileum) tanımlayın ve forseps ve makasla bağ dokusunu ve kan damarlarını çıkarın. Epiteli bozmadan küçük bir 23-25 G iğne ve 3 mL’lik bir şırınga kullanarak lümen içeriğini gerektiği gibi yıkayın. Bağırsak segmentlerini bir neşter kullanarak 3-5 mm’lik parçalara bölün ve buz üzerinde 0.5-1 mL organoid büyüme ortamı içeren 35 mm x 15 mm’lik bir Petri kabına 1-2 parça (6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna kaplama için) yerleştirin. Diseksiyon mikro makas ve forseps kullanarak, bağırsak tüpünü uzunlamasına kesin. Epitel hücrelerini fasyadan 10x stereo mikroskop altında kazımak için forseps ucunu kullanın. Fasyayı çıkarın ve hücre kümelerini parçalamak için çanağı döndürün. 8 mg/mL matris protein konsantrasyonunda 285 μL’lik bir çözelti oluşturmak üzere hücreleri ve ortamları 5-10 μL’lik artışla bazal membran matris karışımına aktarmak için 20 μL’lik bir pipet kesme ucu kullanın. Pipet, 200 μL’lik bir kesme ucu kullanarak buz üzerindeki bazal membran matrisindeki hücreleri karıştırmak için yavaşça 20x yukarı ve aşağı iniyor. Hücre bazal membran matris karışımının beş adet 50 μL şeridini, ılık bir köpük tuğla üzerinde tutulan önceden ısıtılmış 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Bodrum membran matrisinin polimerize olmasına ve sertleşmesine izin vermek için hücre kültürü inkübatöründeki plakayı 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 10 dakika boyunca inkübe edin. Katılaşmış bazal membran matris şeritlerinin kuyucuğuna 2 mL enteroid büyüme ortamı ekleyin ve hücre kültürü inkübatörünün içine geri yerleştirin. Enteroid büyümesini artırmak için medyayı günlük olarak değiştirin. Günlük 10x ters çevrilmiş mikroskop altında bağırsak kök hücre farklılaşmasını kontrol edin. 10-14 gün sonra, enteroid yoğunluğuna bağlı olarak, enteroidleri 12 kuyucuklu veya 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna geçirin. Medyayı her gün değiştirmeye başlayın ve enteroidler gelişmeye başladığında her 5-7 günde bir 1: 2 oranında geçin.Enteroidlere farklılaşmayan hücreleri, geçişler sırasında bazal membran matris tabakası ile çıkarın. Gerekirse,% 80 büyüme ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde dondurarak düşük pasajlı dondurulmuş bir enteroid stoğu oluşturun. 4. Enteroidlerin immünofloresan boyanması NOT: Sabitleme ve boyama işlemi 3 gün sürer. Bu protokolde, modifiye edilmiş bir protokol15 kullanarak çekirdekler (DAPI), epitel belirteçleri (villin, CDX2), lizozim, müsin ve sıkı bağlantı proteinlerini (claudin 2, claudin 3, oklüdin, zonula oklüden-1) sabitledik ve boyadık. Floresan görüntüler konfokal mikroskopla alındı. SabitlemeNOT: Bu işlem genellikle enteroid geçiş veya dondurma prosedürü ile aynı anda yapılır.Enteroid plakayı buzun üzerine yerleştirin. Büyüme ortamını çıkarın ve soğuk DPBS ile 2 kat hafifçe yıkayın. Sabitlenecek ve boyanacak enteroidleri tanımlayın. 200 μL’lik bir kesme ucuyla dikkatlice pipetleyerek veya 1 μL’lik bir aşılama döngüsü kullanarak 12 delikli bir plakaya aktarın. Farklı antikorlarla boyama yapılacaksa enteroidleri ayrı kuyucuklara yerleştirin. Enteroidleri bozmadan 200 μL’lik bir uçla mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. 0,5 mL% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Enteroidlerin bazal membran matrisinden ayrılmasını kolaylaştırmak için plakayı ara sıra döndürün. Enteroidlerin bazal membran matrisinden ayrılmasını belirlemek için kabaca inceleyin. Enteroidleri bozmadan sıvı PFA’yı dikkatlice aspire edin ve atın. PFA’yı ve artık bazal membran matrisini çıkarmak için PBS 3x ile yıkayınNOT: Sıvının stereo mikroskop altında aspire edilmesi, enteroidlerden kaçınmak için yararlı olabilir. Sabit enteroidler PBS’de 4 °C’de 1 aya kadar saklanabilir. EngellemeArtık PBS’yi enteroidleri bozmadan 200 μL’lik bir pipetle dikkatlice çıkarın. 0,5 mL bloke tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Enteroidlerin bozulmasını önlemek için dikkatli olarak bloke edici tamponu 200 μL’lik bir pipetle çıkarın ve atın. Antikor boyamaEnteroidlerle her bir oyuğa bloke edici tamponda 500 μL primer antikor ekleyin. Primer antikorlar ve lizozim için seyreltme faktörü 1:100, CDX2 için seyreltme faktörü 1:100 ve villin için seyreltme faktörü 1:50’dir. Gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün, antikor çözeltisini çıkarın ve PBS ile 3x yıkayın. Her yıkama için 10-15 dakikalık kuluçka süresi bekleyin. 4.3.1.-4.3.2 arasındaki adımları yineleyin. seyreltme faktörü 1:400 olan ikincil antikor için. PBS’de 5 μg/mL’de 500 μL DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, PBS ile 3 kat yıkayın ve her yıkama için 10-15 dakikalık kuluçka süresi bekleyin MontajMümkün olduğunca çok PBS çıkarın. Lekeli enteroidleri% 70 gliserol 1x ile yıkayın. 1 μL aşılama halkası veya kesilmiş 200 μL’lik bir uç kullanarak enteroidleri plakadan çıkarın ve% 70 gliserol ile bir cam mikroskop slaydına monte edin. Enteroidlerin 3D yapısını korumak için, alt cam slayt ile kapak kayması arasında 0,5-1 mm’lik bir boşluk bırakın. Cam sürgü ile kapak kayması arasında bir boşluk oluşturmak için ince silikon kauçuk levha veya cam kapak kayması kesimlerini kullanın. Enteroidler artık konfokal mikroskopla görüntülenebilir. 5. Enteroidlerin mikroenjeksiyonu için hazırlık NOT: Mikroenjeksiyon protokolü, Hill ve ark.16’nın kaynaklara ve ayarlara uyacak şekilde değiştirilmiş bir protokolüdür. Bazı hazırlık adımlarının birkaç gün önceden tamamlanması gerekir. Mikroenjeksiyon kurulumunun yapılmasıMikroenjektör aparatını, deneylerin amacına bağlı olarak, bir biyogüvenlik kabininin içine veya temiz bir tezgaha aşağıdaki gibi kurun: görüntüleme için bir stereo mikroskop, mikroskobun yanındaki ağır bir standa monte edilmiş X-, Y- ve Z ekseni kontrol noblarına sahip bir mikromanipülatör, mikromanipülatör koluna monte edilmiş bir mikropipet tutucu, mikropipet tutucuyu birbirine bağlayan bir mikroenjektör borusu ve üç yönlü bir tıpa ile bir şırınga, daha sonra pnömatik bir pompaya ve pompaya bağlı bir duvar hava kaynağına (Şekil 1). Mikroenjeksiyon aparatını deneysel kullanımdan önce ve sonra etanol ile dezenfekte edin. Mikropipetin hedeflenen numuneye ulaşabilmesini sağlamak için eksen düğmelerinin hareket ettirilmesi de dahil olmak üzere mikroskop ve mikromanipülatörün istenen fiziksel özelliklere uyacak şekilde konumlandırılmasını test edin. Mikropipetin hazırlanmasıNOT: Bu adımları önceden gerçekleştirin.Cam kılcal tüpleri mikropipetlerin içine çekmek için bir mikropipet çektirici kullanın. Stereo mikroskop altında, mikropipeti yatay bir mikropipet tutucuya yerleştirin (Şekil 2), uçlara odaklanın ve mikroskop göz merceklerine bakarken bir çift mikro makas kullanarak uçları kesin. Her deney için benzer uç boyutunda yaklaşık 10-15 mikropipet hazırlayın. 0,5-1 μL sıvı çekerek uç boyutunu test edin ve hacmi boşaltmak için kaç pompanın gerekli olduğunu sayın. Deneme için uygun boyutu bulmak üzere birkaç uç boyutunu test edin. Uygun bir uç boyutu, pompa başına yaklaşık 10-30 nL hacim çıkarır. Kesilmiş cam mikropipetleri, uçlara zarar vermeden temiz bir kutuda veya tüpte saklayın.NOT: Önceden kesilmiş mikropipetler piyasada mevcuttur. Enteroid preparatÇoğunlukla büyük ve küresel enteroidlerden oluşan bir plakayı buzun üzerine yerleştirin. Eski büyüme ortamını taze ortamla değiştirin. Bodrum zarı matris noktalarını bir hücre kaldırıcı ile plakadan yavaşça ayırın. Enteroidleri rahatsız etmeden bazal membran matrisini parçalamak için jel noktalarını buz üzerinde bir yandan diğer yana döndürün. Stereo mikroskop altında kesilmiş 20 μL pipet ucu ile yaklaşık 10-15 küresel enteroid seçin ve 285 μL 8 mg / mL protein konsantrasyon karışımı yapmak için bazal membran matrisine ekleyin. Enteroidleri kırmadan karıştırmak için 200 μL’lik kesilmiş bir uçla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Plaka beş 50 μL jel nokta, yuvarlak bir 35 mm x 10 mm hücre kültürü Petri kabının ortasında veya benzer boyutlarda bir tane. Enteroid jel noktalarını katılaşması için 10 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Ardından, yemeğe 1 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Enteroidleri stabilizasyon için en az 2-3 gün boyunca ve enteroidler 0.5-1 μL’lik uygun bir boyuta ulaşana kadar inkübe edin.NOT: Enteroidlere daha kolay erişim için alçak duvarlı bir tabağa ve daha az hacimli büyüme ortamı için küçük çaplı bir tabağa sahip olmak önemlidir. Dextran-FITC ve test edilmiş malzemenin mikroenjeksiyonuÜç yönlü durdurma musluğunu pnömatik pompaya kapatın. Mikropipeti enjekte edilen malzemeyle doldurun, bu durumda LPS’li veya LPS’siz dextran-FITC. Şeffaf bir film şeridi ile kaplı bir Petri kabı hazırlayın. Film üzerine iki ila dört adet 1 μL enjekte edilen malzeme noktası yerleştirin. Mikropipetin ucunu sıvının hemen içine ancak stereo mikroskobun görselleştirilmesi altında filmin üstüne sürmek için mikromanipülatörü kullanın. Enjekte edilen malzemeyi mikropipete çekmek için şırıngayı yavaşça çekin. Mikropipeti 2-4 μL enjekte edilen malzeme ile doldurun ve mikropipetin ucundaki havayı çıkarmak için şırıngayı itin. Hava cebi olmadığından emin olmak için mikropipetteki enjekte edilen malzeme sütununu kontrol edin. Mikropipetin içine çekilen enjekte edilen malzemenin hacmini kaydedin.NOT: Sıvı, dekstran-FITC nedeniyle yeşilimsi bir renkte görülebilir. Yaklaşık 60 psi hava basıncı sağlayan pnömatik pompaya bağlı hava kaynağını açın. Pompayı açın ve pompa süresini 10-15 ms’ye ayarlayın. Pompadan mikropipete giden hattı açmak için şırıngadaki musluğu çevirin.NOT: Daha uzun pompa süresi, pompa başına daha fazla malzemenin serbest bırakılmasını sağlar. Enjekte edilen hacmin tahmini için tüm deney boyunca aynı pompa süresinin ve benzer uç boyutlarına sahip mikropipetlerin kullanılması önerilir. Enteroidleri hücre kültürü inkübatöründen çıkarın ve mikroenjeksiyondan sonra ışığa maruz kalmayı sınırlamak için bulaşıkları kapalı bir kapta ılık bir köpük tuğlanın üzerine yerleştirin. Petri kabını enteroidlerle stereo mikroskop altına yerleştirin ve mikropipetin ucunu yatay yüzeye yaklaşık 35 ° -45 ° açıyla yerleştirmek için mikromanipülatör düğmelerini hareket ettirin (Şekil 3). Bu önceden biraz pratik gerektirir. Her Petri kabındaki enteroidleri mikroskop altında görselleştirin ve haritalandırın, böylece çanak başına yaklaşık 3-5 küresel enteroid enjekte etmek için bir plan yapın. Mikropipetin ucu sıvı yüzeye yakın olduğunda, ucu hedeflenen enteroide doğru ilerletmek için mikroskop göz merceklerine bakın. Hassas bir yavaş hareket kullanarak z ekseni düğmesini ilerlederek enteroidi mikropipet ucuyla delin. Enteroid duvar, uç enteroid yüzeyden geçtikten sonra bastırır ve geri döner, bu noktada ilerleme durmalıdır. Bir ayağınızla pompa pedalına dokunun ve enteroidi hafifçe genişleyene kadar yeşilimsi dekstran-FITC çözeltisiyle doldurun. Pompalanan hacmi ve dekstran konsantrasyonunu hesaplamak için pompa sayısını kaydedin. Mikroenjeksiyonu bitirdikten sonra mikropipetin ucunu geri çekin ve bir sonraki enteroide geçin. Uygulamayla, süreç sorunsuz bir şekilde ilerleyebilir.Uç kırılırsa, benzer uç boyutuna sahip başka bir mikropipetle değiştirin. Aynı maruz kalma grubundaki tüm enteroidler için yeterli miktarda enjekte edilen materyali çekin ve çapraz kontaminasyonu önlemek için mikropipeti enjekte edilen malzemeler arasında değiştirin. Işığa maruz kalmayı önlemek için enjekte edilen enteroid kabı örtünün altına yerleştirin. Dextran-FITC toplama ve ölçümMikroenjeksiyon işleminden sonra, kültür ortamını derhal çıkarın. Artık dekstran-FITC’yi çıkarmak için taze büyüme ortamı 2x ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve zamanı mikroenjeksiyon sonrası 0 zaman olarak kaydedin.NOT: Mikroenjeksiyon işlemini aksatmadan bu adımı gerçekleştirmek için ikinci bir kişiye ihtiyacınız olabilir. Opak 0,5 mL mikrofüj tüpünde 200 μL kültür ortamı toplayın ve ardından çıkarılan kültür ortamını mikroenjeksiyonlardan sonra 1 saat, 2 saat, 4 saat, 6 saat, 8 saat, 10 saat ve 12 saat sonra aynı hacimde taze büyüme ortamı ile değiştirin.NOT: Zaman aralığı deneye bağlı olarak değişebilir. Bazolateral maruziyet ile, yedek ortam pozlamayı aynı konsantrasyonda içermelidir. Toplanan kültür ortamını 4 °C’de saklayın ve dekstran konsantrasyonunu 24 saat içinde ölçün. Diğer analizler için artık ortamları -80 °C’de saklayın. Kültür medya koleksiyonunun sonunda, gerekirse RNA ekstraksiyonu veya görüntüleme için enteroidleri toplayın. Dextran-FITC konsantrasyonlarını floresan mikroplaka okuyucu ile ölçün. Seri seyreltmeler kullanarak ve Şekil 4’te gösterildiği gibi doğrusal bir regresyon çizgisi takarak her plaka için standart bir eğri oluşturun. Dekstran içermeyen taze büyüme ortamı ile değiştirilen dekstran içeren kültür ortamının çıkarılan hacminin absorbansını aşağıdaki gibi düzeltin: 2 mL’lik kültür ortamından 200 μL’nin çıkarılması hacimce% 10’dur.2 saatte düzeltilmiş absorbans = (1 h x ‘da absorbans + 2 saatte ölçülen absorbansİlk düzeltilmiş ortamın emilimi düzeltmeye ihtiyaç duymaz. Ardından, standart eğri denklemini kullanarak düzeltilmiş absorbans değerinden dekstran konsantrasyonunu hesaplayın. Normalizasyon için, dekstran konsantrasyonunu her Petri kabı için toplam pompa sayısına bölün ve ardından çanak başına en büyük toplam pompa sayısıyla çarpın.NOT: Tüm maruziyetler üçlü olarak gerçekleştirilir (maruz kalma başına üç Petri kabı ve çanak başına 3-5 mikroenjeksiyonlu enteroid). Üçlülerin ortalama değerleri, bir Öğrencinin t-testi kullanılarak maruziyetler arasında karşılaştırılır.