얼음 및 포접 수화물 결정화 연구를 위한 미세유체 접근법

1. 미세 유체 장치 제작 페트리 접시의 내부 표면을 알루미늄 호일로 덮고 미리 준비된 금형을 페트리 접시에 넣습니다.참고문헌에 설명된 리소그래피 기술을 사용하여 금형을 제작합니다. 현재 작업에 사용 된 두 가지 장치 설계가 그림 1에 나와 있습니다. 경화제와 엘라스토머의 1:10(중량비) 혼합물( 재료 표 참조)의 무게를 달고 혼합물이 흰색이고 거의 불투명하게 나타날 때까지 약 5분 동안 계속 혼합하여 PDMS 혼합물 30-40mL를 준비합니다.알림: 플라스틱 컵을 저울에 놓고 엘라스토머를 컵에 부은 다음 경화제를 추가하여 1:10 중량비를 달성하십시오. PDMS 혼합물을 몰드와 함께 페트리 접시에 붓고 기포가 남지 않을 때까지 데시케이터에서 가스를 제거합니다(약 30분). 액체 PDMS로 몰드를 오븐이나 70°C의 핫 플레이트에서 고무와 같은 일관성이 얻어질 때까지 굽습니다. 이 과정은 약 한 시간이 걸립니다. 메스로 피처 주위를 추적하여 장치를 잘라내고 곰팡이가 깨지기 쉽기 때문에 메스를 아래로 누르지 말고 앞으로 밀도록 주의하십시오. 잘라낸 PDMS 장치를 꺼내 새 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다. 접착 테이프를 부착하고 제거하여 바닥면에서 먼지와 먼지 입자를 제거하십시오( 재료 표 참조). 필요한 경우 현미경을 사용하여 무딘 주사기 바늘 (20G)을 사용하여 각인 된 패턴을 기반으로 장치의 구멍을 뚫습니다. 구멍이 장치의 다른 쪽을 관통하는지 확인하고 핀셋을 사용하여 펀치 아웃 조각을 제거하십시오. 커버 슬립 (18 x 18 mm, 두께 0.14 mm)을 물과 비누로 철저히 씻은 다음 이소프로판올로 씻으십시오. 공기 압력을 사용하여 청소된 커버슬립을 건조시킵니다. 청소한 PDMS와 커버슬립을 플라즈마 클리너에 삽입하고 밸브를 닫은 다음 전원, 진공 및 펌프를 켭니다. 플라즈마 클리너를 약 1분 동안 작동시키고 RF를 HI로 설정한 다음 미세 밸브를 사용하여 약간의 공기가 플라즈마 클리너로 들어가도록 합니다.보기 창의 색상이 보라색에서 분홍색으로 바뀌면 플라즈마 클리너가 50초 동안 작동하도록 하고 RF를 끕니다. 펌프를 잠시 켜두었다가 끈 후 메인 밸브를 서서히 열어 공기가 플라즈마 클리너로 들어갈 수 있도록 합니다.참고: 비교 가능한 결과를 얻는 다른 방법은 열 결합입니다. 이 방법의 경우 금형을 커버 슬립에 놓고 70-80 ° C로 설정된 핫 플레이트에 약 60 분 동안 놓습니다. PDMS 표면을 청소된 커버슬립에 누르고 커버슬립을 약간 위로 당길 때 분리되지 않는 것을 관찰하여 접착되었는지 확인합니다. 펜치로 90° 무딘 바늘(18G)의 바늘을 고정하고 플라스틱 주사기 커넥터를 당겨 제거합니다. 바늘의 한쪽 끝을 Tygon 튜브 (0.020 “ID, 0.060″OD, 재료 표 참조)에 삽입하고 다른 쪽 끝을 장치의 천공 구멍 중 하나에 삽입합니다. 다른 구멍에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 기포를 제거하려면 유리 주사기로 채널에 물/버퍼를 주입합니다(펌프는 선택 사항이지만 여기서는 펌프가 사용되지 않음). 장치에 주입하기 전에 0.22μm 필터로 모든 액체를 여과하십시오. 형광 표지된 AFP가 PDMS 벽에 결합하는 것을 방지하기 위해 1% BSA 용액과 같은 차단제를 사용하십시오. 차단제를 입구 채널에 주입하고 20분 동안 마이크로채널에 남아 있도록 합니다. 그런 다음 버퍼 용액을 입구 채널에 주입하여 BSA 용액을 플러시합니다.알림: 결과 PDMS 장치는 바닥 표면을 따라 커버슬립에 부착되고 입구 및 출구 구멍의 튜브에 연결되며 채널의 차단제로 코팅됩니다. 2. 미세유체 장치 설정 구리 콜드 스테이지 표면에 소량의 침지 오일을 바르고( 재료 표 참조) 보풀이 없는 물티슈를 사용하여 펴 발라 얇은 오일 층을 만듭니다. 그런 다음 생성 된 오일 층에 깨끗한 사파이어 디스크 ( 재료 표 참조)를 놓습니다. 침지 오일 방울을 사파이어 디스크의 중앙에 바르고 PDMS 장치를 드롭에 배치하여 장치의 기능이 콜드 스테이지의 보기 구멍 위에 정렬되도록 합니다. 장치를 제자리에 고정하고 접착 테이프를 사용하여 콜드 스테이지를 수용하는 알루미늄 상자의 외벽에 튜브를 고정합니다. 각 특정 튜브의 배치를 기록해 둡니다. 유리 주사기를 사용하여 4-5μL의 AF(G)P 용액( 재료 표 참조)을 입구 채널에 주입합니다. 차가운 단계의 뚜껑을 닫으십시오.참고: AFP 용액의 농도는 형광 강도에 따라 다양하고 결정될 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 농도의 범위는 5-40 μL이었다. 3. 미세유체 채널에서 단결정의 형성 내부에 응결이 형성되는 것을 방지하기 위해 건조한 공기/질소로 차가운 단계를 퍼지하십시오. 순환 냉각 수조를 활성화하여 차가운 단계를 통해 물을 순환시키고 방열판 역할을 합니다. 온도 제어 프로그램을 시작하고 온도를 -25 °C로 설정하십시오.알림: 샘플이 ~-20°C의 온도에 도달하면 동결이 발생하며 이는 샘플이 갑자기 어두워지고 거칠어지는 것으로 관찰될 수 있습니다. 임의의 대물렌즈가 이 시점에서 사용될 수 있으며, 바람직하게는 4x 대물렌즈가 사용될 수 있으며, 이는 사용자가 마이크로유체 채널의 전체를 관찰할 수 있게 한다. 천천히 온도를 약 1 ° C / 5 초 씩 높이면 AF (G) P 용액에 사용 된 버퍼에 따라 -1에서 -0.2 ° C 범위 인 샘플의 융점에 접근합니다. 온도가 녹는점에 가까워지면 몇 개의 단결정이 분리될 때까지 기다리십시오.참고: 필요한 경우 현미경에 고정된 IR 레이저(980nm)( 재료 표 참조)를 사용하여 원하지 않는 얼음을 국부적으로 녹일 수 있습니다. 레이저는 켜져 있는 한 근처의 얼음 결정을 녹입니다. 이 시점에서 단결정을 더 잘 관찰하기 위해 10x 또는 20x 대물렌즈로 전환하는 것이 좋습니다. 원하는 위치에서 단결정을 얻은 후 결정의 가장자리가 채널 벽과 만날 때까지 온도를 약간 낮추어 (~ 0.01 ° C) 결정을 성장시킵니다. 50x 대물렌즈로 전환하고 AF(G)P 용액을 채널에 주입하고 형광 강도 증가를 관찰하여 단백질 용액이 채널에 성공적으로 주입되었음을 나타냅니다. 용액을 교환하는 동안 얼음 결정이 녹지 않도록 이 단계를 신중하게 수행하십시오. 유속(유리 주사기에 더 많거나 적은 압력을 가하여)과 용액 교환 과정 중 온도를 면밀히 모니터링하고 조정합니다. 단백질이 축적되어 결정 표면에 결합할 수 있는 충분한 시간을 허용하십시오.알림: 이는 AF(G)P 5,25의 축적 및 흡착률에 따라 다릅니다. 일반적인 실험에서 AFP 축적에 5-10 분이 허용됩니다. 4. 열 히스테리시스(TH) 활동 측정 참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 0.002 °C의 작은 단계로 온도를 조정하고 작은 결정이 녹지 않고 적용될 수있는 최고 온도를 관찰하여 결정의 융점을 결정하십시오. 온도 컨트롤러의 RAMP 기능에서 냉각 속도를 -0.05에서 -0.01°C/4초로 설정하고 램프를 활성화합니다. 갑작스런 결정 성장이 발생하는 정확한 온도에 유의하십시오.알림: 이 값을 버스트 온도라고 하며 동결 온도에 해당합니다. 용융 온도와 동결 온도의 차이는 TH 활성(25)이다. 5. 단결정 주위의 용액 교환 실험 중 결정의 용융 또는 성장을 방지하기 위해 샘플 온도가 TH 간격에 있는지 확인하십시오. 나중에 형광 데이터 분석을 위해 NIS Elements 이미징 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 용액 교환 프로세스를 기록합니다. 완충 용액을 미세유체 장치의 제2 입구에 천천히 주입하고, 주사기에 가해지는 압력에 의존하는 속도로 형광 신호의 감소를 관찰한다.이 시각적 표현을 사용하여 적용된 압력이 너무 높지 않아 결정이 녹지 않도록하십시오. 그림 2 에서 솔루션 교환 프로세스를 보여 주는 이미지 시퀀스를 참조하십시오. 이미징 프로그램을 사용하여 미세유체 채널에서 형광 강도를 측정합니다.알림: 신호는 AFP 결합을 나타내는 결정 표면 근처의 영역에서 최고조에 달해야 하며 버퍼로 플러시된 주변 용액에서 상대적으로 낮아야 합니다. 단계 4에 이어 용액 교환 후의 TH 활성을 측정한다. 새로운 결정을 분리하여 실험을 반복하십시오 (3.3-3.5 단계). 유리 주사기로 AFP 용액을 주입하고 용액 교환을 반복하십시오 (5.1-5.3 단계). 새로운 단결정 (단계 3.3-3.5)을 얻고 유리 주사기를 사용하여 AFP 용액을 채널 내로 흘려줍니다. 6. 포접 수화물 실험 THF 수화물을 얻으려면 1:15의 몰비(부피비 1:3.326)의 THF/물 용액을 준비합니다. AF(G)Ps 또는 기타 억제제를 포함하는 용액을 포함하여 다음 실험에 사용된 모든 용액에서 이 비율을 유지하십시오. 1단계와 2단계에 따라 미세유체 장치를 준비하고 차가운 단계에 두십시오. 온도를 -25 °C로 설정하십시오. 샘플은 단계 3.2에 설명된 대로 ~-20°C에서 동결됩니다. THF 용액이 얼린 후 모든 얼음이 녹을 때까지 천천히 온도를 높입니다.알림: 얼음의 녹는 점은 THF에 의해 약간 낮아집니다. 수화물을 제외한 모든 얼음 결정이 녹도록하려면 온도를 1 ° C에서 3 분 동안 유지하십시오. 온도를 -2°C로 설정하고 억제제가 없는 상태에서 미세유체 채널에 나타나는 수화물의 풍부함을 관찰합니다.참고: THF 수화물은 팔면체 모양이며(그림 2), 경우에 따라 결정이 매우 얇습니다. 따라서 명확한 관찰이 어려울 수 있습니다. 이 경우 6.4-6.5 단계를 반복하여 새 결정을 얻는 것이 좋습니다. 유리 주사기를 사용하여 AF (G) P / 억제제를 미세 유체 채널에 주입하면서 온도를 조정하여 얻은 결정이 녹거나 성장하지 않도록합니다. 억제제 분자가 결정 표면에 흡착 될 때까지 몇 분 정도 기다리십시오. 필요한 경우 4단계에 따라 TH 활동을 측정합니다. 단계 5.2-5.3에 설명된 대로 결정 주위의 용액을 교환합니다.