Essai gravitaire à grande échelle des larves de Caenorhabditis dauer
Summary
Le présent protocole décrit les méthodes permettant d’effectuer un essai gravitaire à grande échelle avec des larves de Caenorhabditis dauer. Ce protocole permet une meilleure détection du comportement de l’axe gravitationnel par rapport à un test sur plaque.
Abstract
La sensation de gravité est un processus important et relativement peu étudié. La détection de la gravité permet aux animaux de naviguer dans leur environnement et facilite les mouvements. De plus, la sensation de gravité, qui se produit dans l’oreille interne des mammifères, est étroitement liée à l’audition – ainsi, la compréhension de ce processus a des implications pour la recherche auditive et vestibulaire. Des essais gravitationnels existent pour certains organismes modèles, dont la drosophile. Les vers simples ont déjà été testés pour leur préférence d’orientation lorsqu’ils s’installent en solution. Cependant, un essai fiable et robuste pour Caenorhabditis gravitaxis n’a pas été décrit. Le présent protocole décrit une procédure pour effectuer des tests gravitaires qui peuvent être utilisés pour tester des centaines de Caenorhabditis dauers à la fois. Ce test à grande échelle et à longue distance permet une collecte de données détaillées, révélant des phénotypes qui peuvent être manqués sur un essai standard sur plaque. Le mouvement de Dauer le long de l’axe vertical est comparé aux commandes horizontales pour s’assurer que la polarisation directionnelle est due à la gravité. La préférence gravitactique peut alors être comparée entre les souches ou les conditions expérimentales. Cette méthode permet de déterminer les exigences moléculaires, cellulaires et environnementales pour la gravitaxie chez les vers.
Introduction
La détection de l’attraction gravitationnelle de la Terre est cruciale pour l’orientation, le mouvement, la coordination et l’équilibre de nombreux organismes. Cependant, les mécanismes moléculaires et les neurocircuits de la sensation de gravité sont mal compris par rapport à d’autres sens. Chez les animaux, la sensation de gravité interagit avec et peut être dépassée par d’autres stimuli pour influencer le comportement. Des indices visuels, une rétroaction proprioceptive et des informations vestibulaires peuvent être intégrés pour générer un sentiment de conscience corporelle par rapport à l’environnement d’un animal 1,2. Inversement, la préférence gravitactique peut être altérée en présence d’autres stimuli 3,4,5. Par conséquent, le comportement gravitactique est idéal pour étudier la sensation de gravité et comprendre l’intégration sensorielle complexe du système nerveux et la prise de décision.
C. elegans est un organisme modèle particulièrement utile pour étudier la gravitaxie en raison de son cycle de vie polyphénique. Lorsqu’elles sont exposées à des facteurs de stress pendant le développement, notamment la chaleur, le surpeuplement ou le manque de nourriture, les larves de C. elegans se transforment en dauers, qui sont très résistants au stress6. En tant que dauers, les vers adoptent des comportements caractéristiques, tels que la nictation, dans laquelle les vers « se tiennent » sur leur queue et agitent la tête, ce qui peut faciliter la dispersion vers de meilleurs habitats7. Les essais gravitaxis de C. elegans et de C. japonica suggèrent que les larves de dauer ont un gravitax négatif, et que ce comportement est plus facilement observé chez les dauers que chez les adultes 8,9. Le test de l’axe de gravité dans d’autres souches de Caenorhabditis peut révéler une variation naturelle du comportement gravitactique.
Les mécanismes de sensation de gravité ont été caractérisés chez Euglena, Drosophila, Ciona et diverses autres espèces en utilisant les essaisde gravité 3,10,11. Pendant ce temps, les études gravitaxis à Caenorhabditis ont initialement fourni des résultats mitigés. Une étude de la préférence d’orientation de C. elegans a révélé que les vers s’orientent la tête baissée en solution, suggérant une préférence gravitactique positive12. Pendant ce temps, bien que C. japonica dauers ait été identifié très tôt comme étant négativement gravitactique8, ce comportement n’a été décrit que récemment dans C. elegans9. Plusieurs défis se posent dans le développement d’un essai de gravité représentatif chez les vers. Les souches de Caenorhabditis sont maintenues sur des plaques de gélose; Pour cette raison, les tests comportementaux utilisent généralement des plaques de gélose dans le cadre de leur conception expérimentale13,14,15. Le premier essai d’axe gravitationnel signalé chez Caenorhabditis a été réalisé en plaçant une plaque sur le côté à un angle de 90° par rapport à la plaque de contrôle horizontale8. Cependant, le comportement de l’axe gravitationnel n’est pas toujours robuste dans ces conditions. Alors que les vers adultes peuvent être testés pour la préférence d’orientation dans la solution12, cette préférence directionnelle peut également dépendre du contexte, conduisant à des comportements différents si les vers rampent plutôt que de nager. De plus, C. elegans est sensible à d’autres stimuli, y compris la lumière et les champs électromagnétiques16,17, qui interfèrent avec leurs réponses à la gravité9. Par conséquent, un test gravitaxique mis à jour qui protège contre d’autres variables environnementales est important pour disséquer les mécanismes de ce processus sensoriel.
Dans le présent protocole, un essai d’observation de l’axe gravitationnel de Caenorhabditis est décrit. La configuration de cette étude est basée en partie sur une méthode développée pour étudier l’intégrité neuromusculaire18,19. Les larves de Dauer sont cultivées et isolées selon les procédures standard20. Ils sont ensuite injectés dans des chambres fabriquées à partir de deux pipettes sérologiques de 5 ml remplies d’agar-agar. Ces chambres peuvent être orientées verticalement ou horizontalement et placées dans une cage de Faraday sombre pendant 12-24 h pour se protéger contre la lumière et les champs électromagnétiques. L’emplacement de chaque ver dans les chambres est enregistré et comparé aux taxis verticaux d’une souche de référence telle que C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparaison avec les méthodes antérieures
Contrairement à la chimiotaxie, la gravitaxie chez Caenorhabditis ne peut pas être observée de manière fiable à l’aide d’un plan expérimental traditionnel sur plaque d’agar. Une boîte de Petri standard mesure 150 mm de diamètre, ce qui donne seulement 75 mm disponibles dans les deux sens pour que les dauers puissent démontrer la préférence gravitaire. Bien que la préférence d’orientation de C. elegans puisse être dosé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par des subventions de recherche des National Institutes of Health à JHR (#R01 5R01HD081266 et #R01GM141493). Certaines souches ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Nous tenons à remercier Pradeep Joshi (UCSB) pour sa contribution éditoriale. Consultation statistique fournie par l’UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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