Normothermic Ex Vivo Pancreas Perfusie voor het behoud van Pancreas allogläts vóór transplantatie

Alle dieren die voor deze studie werden gebruikt, kregen humane zorg in overeenstemming met de ”Principles of Laboratory Animal Care” geformuleerd door de National Society for Medical Research en de ”Guide for the Care of Laboratory Animals” gepubliceerd door de National Institutes of Health, Ontario, Canada. Alle studies werden goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Toronto General Research Institute. OPMERKING: Dit onderzoeksprotocol is gebaseerd op een varkensmodel. Het transplantaat wordt gedurende 2 uur in de kou bewaard en ondergaat vervolgens gedurende 3 uur normotherme machineperfusie voorafgaand aan de transplantatie (figuur 1). 1. Dieren Gebruik mannelijke Yorkshire-varkens (40-50 kg). 2. Verkrijging van organen OPMERKING: De preoperatieve procedure en een deel van de chirurgische procedure zijn hetzelfde als eerdere artikelen gepubliceerd door onze groep15 en is als volgt: Plaats de varkens minimaal 7 dagen in de onderzoeksfaciliteit om te kunnen acclimatiseren en hun stressniveau te verlagen. Vast de varkens minimaal 6 uur vóór inductie van de anesthesie. Verdoof het varken met een intramusculaire (IM) injectie van midazolam (0,15 mg/kg), ketamine (25 mg/kg) en atropine (0,04 mg/kg).LET OP: Dit gebeurt in de woonvoorziening. Breng het dier over van de huisvestingsfaciliteit naar de operatiekamer (OK), waar het herstel van het orgaan zal worden uitgevoerd. Plaats het varken in rugligging op de OK-tafel en plaats een gezichtsmasker met 2 L zuurstof en 5% isofluraan totdat de kaak ontspannen is. Visualiseer de stembanden met behulp van de laryngoscoop en spuit ze met 2% lidocaïne om spasmen tijdens intubatie te voorkomen. Vervang het masker door zuurstof en isofluraan gedurende ten minste 30 s voordat u probeert te intuberen. Breng een endotracheale buis van 7 mm in en blokkeer de manchet met 5 ml lucht. Gebruik capnometrie om ervoor te zorgen dat de buis in de juiste positie staat. Verlaag het isofluraangas tot 2,5%. Zet de ventilator aan en stel deze in op 15-20 ademhalingen/min en het getijdenvolume op 10-15 ml/kg lichaamsgewicht. Controleer de hartslag en zuurstofverzadiging constant. Gebruik de Seldinger-techniek 16 om een katheter van 8,5 Fr. x10 cm in de halsader (rechts of links) in te brengen. Gebruik de halsaderkatheter om een infusie van fentanyl (2,5 ml in 500 ml Ringer) te starten bij 250 ml / uur. Controleer spierreflexen om de diepte van de anesthesie te bepalen. Kaaktoon is de meest betrouwbare spierreflex 17.OPMERKING: Als de stijfheid van de mandibulaire spieren wordt opgemerkt, verhoogt u de infusie met isofluraan en/of fentanyl. 3. Chirurgische ingreep Desinfecteer en bedek het operatieveld. Voer een middellijnincisie uit van het xyfoïde naar de symfyse van de schaamstreek. Breid het operatieveld uit met een linker laterale incisie voor een betere belichting. Ontleed de inferieure vena cava (IVC) van de abdominale aorta. Bevrijd de aorta verder van het omliggende weefsel en ligaat de kleine lumbale aortatakken. Identificeer en plaats ligaturen rond beide nierslagaders.OPMERKING: De ligaturen mogen op dit tijdstip niet worden vastgebonden. Zodra de achterkant van de aorta vrij is, passeert u er twee ligaturen omheen. De onderste ligatuur zal uiteindelijk net boven de iliacale arterie bifurcatie worden gebonden en de bovenste ligatuur zal 5 cm boven de vorige stropdas worden gebonden. Ontleed het hepatische hilum. Bind alle slagaders zo dicht mogelijk bij de lever. Identificeer het gemeenschappelijke galkanaal, plaats twee ligaturen dicht bij de lever en verdeel de structuur. Ontleed rond aorta, maar snijd niet op dit tijdstip. Identificeer en ontleed rond het suprahepatische deel van de aorta en plaats er een stropdas omheen.OPMERKING: De ligaturen mogen op dit tijdstip niet worden vastgebonden. Open de kleine zak om ijs de alvleesklier te laten afkoelen. Mobiliseer de alvleesklier zo min mogelijk voor het spoelen. Dien 500 IE heparine per kg donorgewicht toe via de centrale lijn. Wacht 5 minuten en begin met bloedafname in citraat-, fosfaat-, dextrose-, zoutoplossing-, adenine-, glucose- en mannitol-zakken (CPD / SAG-M) met behulp van de jugulaire katheter. Bind de inferieure aortaligatuur vast, cannuleer de aorta met een vlakke lijn boven de iliacale bifurcatieband en zet de canule vast met een bovenste stropdas. Ligaat beide nierslagaders. Bind de suprahepatische aorta (crossclamp) zodra er voldoende bloed is verzameld (600 ml). Dien 10 ml kaliumchloride toe als offer. Start een flush met de conserveringsoplossing van de Universiteit van Wisconsin (UW). Knip een opening in de poortader (zo hoog mogelijk) en cava voor ontluchting. Plaats ijs in de buikholte. Beoordeel de alvleesklierstaart en de twaalfvingerige darm C-lus na het spoelen van 1 L UW-oplossing. Indien voldoende spoeling, begin met dissectie, identificeer en klem mesenteriale vaten. Vertraag het spoelen voor de tweede liter UW. Haal het pancreastransplantaat en een segment van cava of iliacale ader op voor uitbreiding van poortader.OPMERKING: Het pancreastransplantaat wordt verwijderd met de milt. Plaats het orgel in een orgelzak die in een met ijs gevuld bassin wordt geplaatst. 4. Voorbereiding van de rugtafel van het pancreastransplantaat (figuur 2A) Verwijder de spoellijn van het distale deel van de aorta en sluit af met een stropdas. Vul de orgaanzak met de resterende UW-oplossing. Bevrijd de alvleesklier van aanhangend weefsel, inclusief de milt. Voer poortaderverlenging uit met behulp van eerder herstelde cava of iliacale ader met 6-0 Prolene. Kannuleer de poortader en proximale aorta met een 1/4 in x 3/8 in reducer. Kannuleer het distale deel van de twaalfvingerige darm met Malecot-katheter en stropdas. Klem het uiteinde van de katheter vast om morsen van de twaalfvingerige darminhoud te voorkomen. Overzag mesenteriale vaten met 4-0 Prolene. Registreer het gewicht van de ent. Bewaar de ent in statische koude opslag (SCS) tot de start van de NEVPP. 5. Normothermische ex vivo pancreasperfusie (NEVPP) OPMERKING: Het perfusiecircuit is gemaakt van neonatale cardiopulmonale bypass-apparatuur (figuur 3). Bevestig de overeenkomstige slang aan de oxygenator en aan het veneuze reservoir, evenals de arteriële lijn aan de uitstroom van de oxygenator en plaats het bellenfilter in de houder. Sluit de spoellijn aan die van het bellenfilter naar het veneuze reservoir gaat. Open de bellenfilterdop om alle lucht naar buiten te laten. Verbind de veneuze lijn met de inlaat van het veneuze reservoir. Sluit het dialysefilter en de slang aan waar dialysaat zal worden toegediend. Sluit de flowmetersensor, drukleidingen en de temperatuurvoeler aan. Verbind de arteriële en veneuze monsterlijnen met de monsterpoorten. Plaats de pancreaskamer (figuur 3) op een Mayo-tafel en breng de arteriële en veneuze buizen door de daarvoor bestemde gaten. Sluit de externe verwarmingseenheid aan en schakel deze in. Plaats de zuigslang in de rolpomp en sluit het ene uiteinde aan op de slang die uit de kamer komt om de vloeistoffen te verzamelen, en het andere uiteinde op het veneuze reservoir om alle orgaanverliezen van perfusaat te verzamelen. Sluit de zuurstofslang (groen) aan op de gastank met daarin het carbogenmengsel (95% O 2/5% CO2) en de oxygenator. Sluit de slang van de kachelpomp aan op de oxygenator. Klem arteriële en veneuze uitstroomlijnen, evenals de uitstroom van het veneuze reservoir. 6. Voorbereiding van het perfusaat en priming van het circuit Vul het veneuze reservoir met het perfusaat (tabel 1). Gebruik één spuitpomp voor continue toediening van de vaatverwijder (epoprostenol) met 8 ml/uur in de arteriële lijn. Gebruik een tweede spuitpomp voor continue toediening van de enzymremmer rechtstreeks in het veneuze reservoir (15 mg, 10 ml / uur). Schakel de hartlongmachine (HLM) in en start de druk-, temperatuur- en timerpanelen op. Zet de verwarmingspomp aan om de perfusieoplossing te verwarmen tot 38 °C. Open de O 2/CO2-voeding. Verwijder de slangklem die op de uitstroom van het veneuze reservoir is geplaatst, start de centrifugaalpomp en neem deze tot 1.500 tpm. Klem de slang vast, omzeil het arteriële filter en laat lucht uit het arteriële filter ontsnappen. Nul de arteriële en veneuze drukleidingen. 7. Pancreastransplantaatperfusie (figuur 2B) Open de orgaanzak waar de alvleesklier is opgeslagen. Spoel met 200 ml albumine door de arteriële canule. Verwijder de alvleesklier uit het ijs en plaats deze in de orgaankamer. Controleer of de arteriële en veneuze slangen luchtvrij zijn. Laat de klem los van de arteriële kant en klem de snelkoppeling tussen de arteriële en veneuze buis. Zodra er bloed uit arteriële slangen begint te komen, verbindt u de lijn met de arteriële canule. Stel de arteriële druk in op 20-25 mmHg door de snelheid van de centrifugaalpomp te regelen. Verbind veneuze slangen zodra er bloed uit de veneuze canule begint te komen. Dien één injectieflacon verapamil (2,5 mg / ml) direct aan de arteriële kant toe, wanneer de alvleesklier volledig is aangesloten en er geen grote bloedingen worden waargenomen. Registreer continu drukken, arteriële stroming, temperatuur en twaalfvingerige darmsecretie. Verzamel bloed, registreer de duodenale output elk uur en beoordeel elk uur macroscopisch op oedeem. Noteer de perfusieparameters en neem monsters voor analyse (veneuze en arteriële bloedgasmonsters, evenals monsters voor amylase, lipase en LDH). Koppel arteriële en veneuze slangen los wanneer de perfusie voorbij is, verwijder het transplantaat uit de orgaankamer en spoel met koude UW en weeg. Bewaar transplantaat op ijs in een steriele orgaanzak tot het moment van transplantatie.