チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

1. DsiRNAの設計と再構成 Safari、Firefox、または Microsoft Edge を使用して、IDT の Web サイト (https://eu.idtdna.com) にアクセスします。ホームページから、[製品とサービス ] タブを選択し、その後に RNA 干渉を選択します。 Fut8遺伝子 を標的とするカスタムダイサー基質(DsiRNA)コンストラクトを生成するには、 デザインツール を選択してから カスタムDsiRNAを生成 タブを選択します。 Fut8アクセッション番号を入力するか、開始する遺伝子配列を手動で入力します。この研究では、「CHO-K1」および「チャイニーズハムスター」の両方のエントリから提案されたFut8配列を https://chogenome.org から取得し、DsiRNAの生成に使用した。ほとんどの遺伝子にはいくつかの転写バリアントがあり、DsiRNAが現在のアセンブリで報告されたすべてのバリアントで活性であることを確認することが重要です。 CHO細胞ゲノムは現在、IDTのウェブサイトで「参照ゲノム」として利用できないため、「手動BLAST」検索を実行するオプションを選択します。このステップでは、カスタム DsiRNA 配列と目的のゲノムとの間の一致を検索します。 「 検索 」をクリックして、DsiRNA 配列を生成します。 次に、税番号:10029(CHO細胞株およびチャイニーズハムスター)の「手動BLAST」機能を使用して、各DsiRNAの特異性を評価します。クエリカバレッジの結果は、DsiRNA構築物がFut8(Fut8転写変異体を含む)に100%一致することを示していますが、意図しない標的に対する相補性は≤76です。 DsiRNAが Fut8 を特異的に標的としていることを確認し、GC含量が30%〜50%であることを確認します。低いGC含量は弱く非特異的な結合と関連しており、一方、GC含量が高いとsiRNAの巻き戻しおよびRISC複合体への装填が阻害される36。 トランスフェクション研究で使用するために3つのDsiRNAを選択し(表1)、それぞれが Fut8 遺伝子の異なる位置を標的とする。コントロール実験のために、事前に設計された非ターゲティングまたはスクランブルされたDsiRNAをIDT社から購入してください。 到着したら、DsiRNAを13,300 x gで1分間遠心分離してペレットにし、チューブを開きます。凍結乾燥した各DsiRNAをヌクレアーゼ非含有二本鎖緩衝液(IDT社提供)中で100μMストック溶液に再構成する。例えば、2 nmolのDsiRNAに20 μLの緩衝液を加えて、100 μMストックを得る。 十分な混合を確実にするために、オービタルシェーカー(50rpm、16mm軌道)上で穏やかに振とうしながら、ストック溶液を室温で30分間インキュベートする。 Fut8 を標的とする各 DsiRNA 構築物 20 μL (各 DsiRNA の 100 μM) を組み合わせてマスターミックスを作成します。アリコートを用意し、-20°Cで保存する。 DsiRNAターゲット 順序 GC (%) 構造 A 5′ ガガアガアガアカグカウアアアック 3′ 36% 5′ グァウウガクグウクウクウク 3′ 構造 B 5′ アガアウガガウガウガウガウグウウウウウククト 3′ 32% 5′ AAGGAAAAACAUCCAUUCAUUCAUUCUGA 3′ 構造 C 5′ アガガガアウアガアカガアカアウアック 3′ 32% 5′ グアウウガクグウクウクアウクウクウククウ 表 1. Fut8 ノックダウンに使用したDsiRNA配列。 チャイニーズハムスターおよびCHO K1細胞ゲノム中の Fut8 を標的とするIDTによって生成された配列。各構築物のセンス配列およびアンチセンス配列が(それぞれ)示され、各構造のGC含量が表示される。Kotidisらより転載。52。 2. DsiRNAトランスフェクション IgGモノクローナル抗体37 を発現するCHO細胞を目的の細胞株に適した培養条件を用いて復活させる。注:この研究で使用された細胞は、内因性GSがL-メチオニンスルホキシミン(MSX)によって阻害され、希少な高生産クローンの選択を強化するグルタミン合成酵素(GS)システムを使用して生成された。したがって、MSXは、選択した細胞株で必要な場合にのみ使用してください。 細胞のバイアルを37°Cに設定した水浴中で2〜3分間解凍する。 バイアルの外側を70%(v/v)エタノールで清掃し、クラスIIバイオセーフティキャビネットですべての作業を続行します。 細胞懸濁液を、選択した細胞株に適した9mLの予備加温培地を含む15mL遠沈管に移す。100 x gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化する。 細胞ペレットを乱すことなく、培地を慎重に取り出して廃棄する。次いで、細胞ペレットを予め加温した培地10mLに再懸濁し、計数のためにアリコートを取る。 血球計数器で計数する場合はトリパンブルーで細胞を染色し、自動細胞カウンターを使用する場合は生細胞と死細胞を区別するために適切な染色を行います。 いずれかの列挙方法に従って、適量の細胞懸濁液を、30 mL の培地中 3 x 10 5 cells·mL-1 の生細胞密度で125 mL の三角振とうフラスコに移します (オプションで 50 μM MSX を補充します)。 細胞を36.5°Cに設定したインキュベーターに移し、5%CO2 、150rpm(16mm軌道)で振とうプラットフォーム上に置いた。 250 mL 三角振とうフラスコに 2 x 105 cells·mL-1 の播種密度で 50 mL の作業容量で 3 ~ 4 日ごとに細胞を継代します。MSXを使用する場合は、最初の継代後に補充を中止してください。 継代細胞2xは融解に加えて行う。 トランスフェクション 細胞密度を評価し、細胞生存率が90%より大きいことを確認する。 汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネットとすべての機器を70%(v/v)エタノールとRNase阻害剤溶液で慎重に清掃してください。 ペレット細胞を100 x gで5分間、予温した培地に再懸濁して、5 x106 細胞・mL-1の生細胞密度にする。 DsiRNAマスターミックスまたはコントロールの8 μL(1 μMに相当)を滅菌(0.4 cm)エレクトロポレーションキュベットに移す。次いで、800μLの細胞懸濁液(4 x106 細胞に相当)を同じキュベットに移し、両方の成分が混合されていることを確認する。 次のパルス条件を提供します:1200 V、0.1 ms、方形波形。 細胞懸濁液をキュベットから6ウェルプレートの1ウェルに移し、泡状物質を避けるように注意する。細胞をインキュベーター(36.5°C、5%CO2)で10分間振盪することなく回収する。 800 μLの予備加温培地を加えて1ウェルあたり1.6 mLの最終容量を作り、トランスフェクトした細胞をインキュベーターに戻し、150 rpm(16 mm軌道)で振とうしながら増殖させます(36.5°C、5%CO2)。 トランスフェクション後48時間で上清および細胞を回収する。停止点:細胞培養上清を-20°Cに保持することができる;ただし、タンパク質分解を避けるために、細胞ペレット収集直後に細胞溶解を行うことをお勧めします。上清はステップ3、ステップ4、およびステップ5で使用され、細胞ペレットはステップ6で使用される。 3. IgG の定量と精製 生体層干渉法または選択した別の方法を使用してIgG濃度を測定します。 タンパク質Aバイオセンサーチップをサンプル希釈液に10〜30分間水和させる。その間、細胞懸濁液を15 mL遠沈管に移し、細胞を100 x gで5分間ペレット化するか、0.45 μmニトロセルロースフィルターでろ過して細胞を除去します。 ペレットを乱すことなく、IgGを含む単離された上清を清浄な遠沈管に注意深く移す。 バイオレイヤー干渉計には、シェーカー速度、2200rpmの設定を使用します。実行時間、60秒。これらのパラメータは、すべてのサンプルとコントロールを測定するために使用されます。 バイオセンサーチップが水和したら、IgG 標準 (各濃度の 4 μL) を使用して標準曲線を作成します。 4 μLの細胞上清を装填してサンプル濃度を定量する。各サンプル間の糸くずの出ないワイプで装置を清掃します。 標準曲線を未知サンプルにリンクして、未知サンプルの結合率を補間します。データを保存し、csv または PDF ファイルとしてエクスポートします。 IgG 精製 0.2 Mグリシン(pH 2.5)を含む溶出バッファーを調製し、0.22 μmフィルターを通して滅菌します。 単離された上清のフィルター1 mLを、上清全体が流れるまで0.22 μm微量遠心フィルターチューブを用いて室温で分析した。 プロテインAアガロースビーズ150〜200 μLを100 x gの1.5 mL遠沈管に3分間ペレット化し、上清を廃棄する。次いで、プロテインAビーズを150〜200μLの細胞培養培地で洗浄し、遠心分離を繰り返す。上清を捨てる。 平衡化したプロテインAビーズを、ステップ3.2.3から調製した上清の1mLで再懸濁する。1mLポリプロピレンチューブにロードします。ポリプロピレンチューブをロータリーミキサー(15mm軌道)に貼り付け、室温で30〜90分間、または4°Cで一晩回転させる。 インキュベーションが完了したら、フロースルーを収集し、ビーズを1mLの1x PBSで洗浄して、結合していないタンパク質を除去します。洗浄画分も集めてください。 ポリプロピレンカラムに溶出バッファー 3 mL を加えることにより、プロテイン A ビーズから IgG を溶出します。カラムから排出される連続画分 (それぞれ 500 μL) を標識チューブに集めます。 オプション: 精製抗体を保存する場合は、1 M Tris pH 9.5 を 25 μL 加えて溶出バッファーを中和します。抗体がバッファー交換などによって直ちに処理される場合は、この手順をスキップしてください。注:精製のすべての部分(フロースルー、洗浄、およびすべての溶出画分)は、標的タンパク質が失われないように保管する必要があります。これらのサンプルは、精製が成功しなかった場合のトラブルシューティングにも役立ちます。 下流処理には最初の溶出(溶出A)を使用しますが、将来必要になる場合は他のすべての画分を保持します。 4. バッファー交換とサンプル濃度 IgG 溶出バッファーを 1x PBS と交換します。 溶出 A を 3 kDa 分子量の分画遠心濃縮器にロードします。適切なMWCOカラムを選択する際には、製造元のガイドを参照してください。この実験では、孔径が小さいほど、分泌タンパク質の最大の保持が保証されますが、遠心分離時間も長くなります。 13,300 x gで4°Cで40〜50分間遠心分離する。 遠心分離は、残留容量が50μL以下になると完了します。 フロースルーを破棄し、500 μLのプレチルド(4°C)1x PBSを加えて残留上清を希釈する。同じ条件(13,300 x g、4°Cで40-50分間)を用いてサンプルを再び遠心分離し、50 μLの残留上清が残るまで遠心分離した。 500 μLのプレチルド(4°C)1x PBSを加えて残留上清を希釈し、再度遠心分離処理を繰り返して上清の100倍希釈液を得た。 上清を終濃度〜2.5g·L-1を 40 μL以下で、糖鎖分析法との相溶性を確保した。注:グリカン分析には100μgをロードする必要があります。停止点:濃縮されたIgG(1x PBS中)は−20°Cで保存し、グリカン分析の前に解凍することができます。 5. 糖鎖分析 製造元の指示に従ってキャピラリーゲル電気泳動を用いてグリカン分析を行う。 磁気ビーズ溶液200 μLを0.2 mL PCRチューブに移し、磁気スタンドの上に置き、ビーズを上清から分離した。 上澄み液を慎重に取り除き、磁気スタンドからチューブを取り外します。精製されたタンパク質サンプルと渦を加えて、完全な混合を確実にします。 変性緩衝液(付属)をサンプルチューブに加え、60°Cで8分間インキュベートした。 最適な反応性能を得るために、サンプルチューブを開いたままにしておきます。 PNGase F(サンプルあたり500単位)を加え、60°Cで20分間インキュベートして、精製抗体からグリカンを切断する。 N-グリカンの放出に続いて、サンプルチューブを閉じ、渦巻きする。アセトニトリル、ボルテックスを加え、室温で1分間インキュベートした。 サンプルチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを溶液から分離します。ピペットを使用して、ビーズに触れることなく上清を慎重に取り除きます。 ヒュームフード内で、フルオロフォアを含むグリカン標識溶液をサンプルに加える。ボルテックスは十分な混合を確実にし、60°Cで20分間インキュベートする(蓋を開ける)。 サンプル3xをアセトニトリルで洗浄し、過剰な色素を除去した。次いで、標識グリカンをDDI水(供給)に溶出させる。 磁気スタンドにサンプル管を置き、精製および標識されたグリカンを含む上清からビーズを分離する。 グルコースはしご標準、ブラケット標準、およびサンプルを準備し、指定されたトレイ位置にロードします。糖鎖分析プロトコルを実行します。 適切なソフトウェアを使用して、サンプル中に存在するグリカンを分析および同定します。メモ: ヒートブロック内の温度が正確であることを確認して、効率的なインキュベーションを行います。 6. ウェスタンブロット 抗α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ抗体を用いたウェスタンブロット分析を用いてノックダウン効率を定量する。ポリアクリルアミドゲルおよび緩衝液レシピは、商業的供給業者から入手可能である38,39。 トランスフェクション後 48 時間で、血球計数器または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、5 x106 細胞に相当する細胞懸濁液の体積を決定します。 各実験条件からの適量の細胞懸濁液を滅菌1.5mL遠沈管に移し、13,200 x gで4°Cで10分間ペレット化する。 上清を捨てる。 1%v/vプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む200 μLの溶解バッファー(哺乳動物細胞からのタンパク質の抽出に適している)で室温で10分間細胞を溶解する。インキュベーション中に混合物を穏やかに振る(50rpm、16mm軌道)。 細胞破片を除去するには、溶解液を13,200 x gで10分間遠心分離し、次いで、除去した溶解物を滅菌1.5mLチューブに移す。 各溶解液のタンパク質濃度を280nmで分光光度計を用いて測定する。続いて、同じタンパク質濃度となるように調整した各試料のアリコートを調製する。 DTT-SDSサンプルローディング色素中で100°Cで10~15分間インキュベートすることによりタンパク質サンプルを変性させる;最終染料濃度は1xです。 15 μL の変性サンプルと 5 μL のプレステインタンパク質ラダーを、効率的な分離のために 12.5% の分割ゲルを含む SDS-PAGE ゲルにロードします。サンプルをゲルあたり 25 mA で 90 分間、または色素の前面がゲルの端に達するまで実行します。 ゲルをカセットから慎重に取り出し、メタノールを含む1xトランスファーバッファー中でインキュベートします。 湿式移送システムを準備し、メタノールでPVDF膜を活性化する。湿式転写用のゲルとPVDF膜を組み立て、移送タンクにアイスブロックを配置し、タンク全体を氷に沈めて、移送条件が冷たいままであることを確認します。350 mA/100 V で 60 分間実行します。 50rpm(16mm軌道)のオービタルシェーカー上で穏やかに振とうしながら、室温で30分間ブロッキング溶液中でインキュベートすることによって膜を遮断する。 滅菌水で膜を5分間すすぎ、繰り返します。次に、きれいなメスを使用して、目に見えるタンパク質はしごをガイドとして使用して、膜を〜50kDaで水平に慎重に切断します。 50kDaを超えるタンパク質を保有する膜を抗α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ抗体と共に抗体希釈バッファー中で1:1000でインキュベートする。希釈バッファー中の1:10,000で抗GAPDHと共に50kDa未満の固定化タンパク質と共に膜をインキュベートする。膜は、室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートすることができる。 メンブレンを5分間洗浄し(x3)、適切な二次抗体とともに室温で少なくとも30分間インキュベートします。 洗浄バッファーで3回洗浄を5分間行い、続いて水で3回洗浄します。次いで、バンドが現れるまで(1〜60分間)、発色基質(または適切な検出試薬)で膜を発達させる。 メンブレン2xを水ですすぎ、乾燥させます。膜の画像をキャプチャし、濃度測定分析40を実行する。 各サンプルにおける相対タンパク質発現を計算するには、まずサンプル中のGAPDHシグナルの比率を計算する。これは、サンプル負荷量の不一致を補正する各サンプルの正規化係数です。 (各レーンの)FUT8シグナル強度を対応するレーンの正規化係数で除算し、相対的なFUT8タンパク質発現を得る。