Ex Vivo神経生理学のためのラット坐骨神経の調製

インシリコでモデル化した基本的な神経機能の現在の理解は、いくつかの側面、特にソーマ、軸索、および樹状突起の外側の神経組織区画化の影響に関して欠けている。軸索-ミエリン相互作用は、従来の電気刺激応答を適切に捕捉するMRG¹(哺乳動物神経用)などの詳細な計算神経モデルでさえ、高周波ブロックキャリー^{オーバー2}または二次発症応答³などの実験的に観察された他の行動を捕捉しないという事実によって証明されるように、依然として十分に理解されていない。

このプロトコルは、標準化された調製プロトコルを使用して神経を単離し、その環境を制御し、in vivoの文脈からex vivoの文脈にそれを除去するために、急性小型実験動物モデルにおける神経レベルで神経生理学的プロセスを効率的に調査する方法を提供する。これは、in vivo神経刺激プロトコルによって使用される他の身体プロセスまたは麻酔薬が神経行動を変化させ、測定結果またはそれらの解釈を混乱させるのを防ぐであろう^4,5。これにより、あまり理解されていない神経組織に特異的な効果のみに焦点を当てたより現実的なモデルの開発が可能になります。このプロトコルは、新しい神経刺激および記録電極材料および形状、ならびに高周波ブロック^2,3などの新しい刺激パラダイムのテストベッドとしても有用である。この技術の変形は、例えば、イオンチャネルのダイナミクスおよび特性または局所麻酔薬⁷の効果を測定するために、厳密に制御された条件⁶における神経生理学を研究するために以前に使用されてきた。

この技術は、急性 インビボ 小動物実験⁸などの代替物と比較していくつかの利点を提供する。この技術は、組織が身体から抽出されたときに麻酔の深さを維持する必要性を排除し、麻酔薬ディフューザー、酸素濃縮器、加熱パッドなどの必要な機器の量を減らす。これにより、実験プロトコルが簡素化され、ミスのリスクが軽減されます。麻酔薬は潜在的に神経機能⁴を変化させる可能性があるため、この技術は、これらの麻酔薬化合物からの副作用によって測定値が混乱しないことを確実にする。最後に、この技術は、麻酔をかけられた動物を麻痺によって殺すテトロドトキシンなどの神経毒性化合物の効果を研究する際に、急性 のin vivo 実験よりも適切である。

末梢神経切片は、記録された神経信号の原因となる線維が体腫を含まない可能性が高いため、ユニークな エクスビボ システムです。これらは通常位置するように、運動ニューロン、脊椎、および脊椎の隣の背根神経節の感覚ニューロンの場合、哺乳類神経のセクションの調製は、両端に開いたイオンチャネルを有する管状膜の集合体として大まかにモデル化することができる⁹。代謝は、組織郭清¹⁰時に軸索に位置するミトコンドリアによって維持される。軸索腫の開放端の縫合は、抽出後にそれらを閉じるために奨励され、それによって正常な神経機能に不可欠な膜を横切る既存のイオン勾配を維持するのに役立つ。

組織恒常性を体外で維持するためには、いくつかの環境変数を厳密に制御する必要があります。これらは、温度¹¹、酸素化¹²、浸透圧、^pH13、14、および代謝を維持するためのグルコースへのアクセスである。このプロトコールの場合、アプローチは、酸素と二酸化炭素の混合物で連続的に通気された修飾クレブス・ヘンゼライト緩衝液^15、16(mKHB)を使用することである。このmKHBは、例えばエクスビボ実験において、解剖された組織を体外に保存するために使用される心麻痺緩衝液^6,17のファミリーにある。これらの緩衝液は、ヘモグロビン、抗生物質、または抗真菌剤を一切含まず、したがって、限られた時間の間、少量の組織を含む調製物にのみ適している。pH制御は、炭酸塩と二酸化炭素の酸化還元対で達成され、pH平衡を維持するために二酸化炭素による緩衝液の一定の曝気を必要とした。これは、神経細胞機能¹⁸を改変することができるHEPSなどの他の一般的な緩衝剤の使用を避けるためである。緩衝液を酸素化し、pH制御を提供するために、カルボゲンと呼ばれる酸素中の5%二酸化炭素の混合物(95%O2、5%_CO2)を使用した。緩衝液容器の温度制御に加熱攪拌機を用い、緩衝液を神経浴中で灌流した後、出発容器に再循環させた。典型的な実験は、神経がその生存能力を失い、健康な組織を代表する尺度のための刺激にもはや十分に反応しなくなる前に、6〜8時間持続するであろう。

信号対雑音比を最適化するために、塩化銀電極を記録に使用し、これは先に記載した方法¹⁹に従って調製した。刺激のために、市販の白金カフ電極とカスタムメイドの導電性ポリマーカフ電極の組み合わせを使用することができる。導電性ポリマーカフ電極は、著しく高い電荷容量を有し、これは、高振幅波形²⁰を用いて神経を刺激するときに有用である。

このプロトコルで使用される刺激器は、以前に²⁰に記載された。ドキュメント、デザインファイル、およびそれを使用するためのソフトウェアスクリプトは、一般に公開されています²¹.他の刺激器は、このプロトコルを実行するために使用することができる。しかし、カスタム刺激器は、高周波代替電流(HFAC)ブロック^2,20も可能であり、より広い範囲の神経生理学実験を可能にする。HFACブロックを使用するには、神経への損傷を避けるために導電性エラストマーカフをお勧めします。導電性エラストマー神経カフは、導電性成分としての導電性エラストマーおよび絶縁体としてのポリジメチルシロキサン²²から製造された柔らかく完全にポリマーの電極アレイである。デバイスは、従来のレーザー微細加工技術を用いてバイポーラ構成で製造された。