用于检测人类精子功能缺陷的生物标志物的流式细胞术分析

注：通过流式细胞术检测精子功能损伤生物标志物的工作流程包括（1）细胞制备，（2）荧光试剂染色，以及（3）流式细胞术分析和数据解释（图1）。该协议遵循陆军医科大学伦理委员会 （1.0/2013.4-12） 的指导方针。 1. 细胞制备 通过在塑料临床标本罐中手淫获取人类精液样本，最好在禁欲 3-5 天后。 立即将精液样品在37°C培养箱中孵育，并将样品完全液化（最多1小时）。 2. 使用计算机辅助精子分析（CASA）计数精子细胞 将液化精液样品彻底混合。 将 10 μL 精液加入精子计数室中（参见 材料表）。 扫描精子类别分析仪中的载玻片（参见 材料表），并计算至少六个区域和 400 个精子以估计精子浓度。注意：精液样本必须是新鲜的，而不是冷冻的，用于精子凋亡和MMP分析。 3. 精子细胞染色 使用 Annexin V-FITC/PI 染色检测精子凋亡将 1 × 106 个精子细胞加入 1.5 mL 离心管中。 用 500 μL 冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞。 将精子细胞悬液以300× g 离心7分钟，弃去上清液。 将精子细胞重悬于200μL的1x结合缓冲液中。 加入 2 μL FITC 膜联蛋白 V 和 2 μL PI（参见 材料表）。 轻轻涡旋细胞，在室温（25°C）下在黑暗中孵育15分钟，并立即将其置于流式细胞仪中进行分析。 使用 JC-1 探针分析线粒体膜电位将 2 × 106 个精子细胞加入 1.5 mL 离心管中，并以 600 × g 离心 5 分钟。 将精子细胞悬液重悬于1mL的JC-1工作溶液中（参见 材料表）。 轻轻涡旋细胞，并在37°C下在黑暗中孵育20分钟。 将悬浮液以600× g 离心5分钟，弃去上清液。 用 1 mL PBS 以 600 × g 的速度洗涤沉淀两次，每次 5 分钟。 将染色的精子细胞重悬于流式细胞仪管中的1mL PBS中，并立即将管置于流式细胞仪中进行分析。 使用羰基氰间氯苯腙（CCCP）作为阳性对照。将精子细胞（如步骤3.2.1中所述）重悬于1mL的CCCP工作溶液中（参见 材料表），并轻轻涡旋细胞并在室温下孵育20分钟。将悬浮液以600× g 离心5分钟，弃去上清液。重复步骤 3.2.2-3.2.6。 精子染色质结构测定将液化的原始精液（0.25mL）等分试样放入冷冻管中，并立即将精液样品冷冻在液氮（-196°C）中，直到准备好进行SCSA。 在37°C水浴中解冻精液样品，并用TNE缓冲液（参见 材料表）稀释至1-2×106 个细胞/ mL的浓度。 将稀释的样品加入流式细胞仪试管中，并将其与400μL酸溶液（参见 材料表）混合30秒。 用 1.2 mL AO 染色溶液对样品进行染色（参见 材料表），并立即放入流式细胞仪进行分析。 使用参考样品作为流式细胞仪设置和校准的内标。用4°C TNE缓冲液将参考样品稀释至1-2×106 个细胞/ mL的浓度。重复步骤 3.3.1-3.3.4。注意：所有溶液和缓冲液均储存在4°C。 （1）精液在快速冷冻前不应稀释。在流式细胞术测量时，应解冻原始精液样品并用TNE缓冲液稀释。（2） 对于不孕不育门诊，~0.25 mL 生精液应在超冷冰箱或 LN2 罐中快速冷冻。然后，这些冷冻等分试样可以在干冰或 LN2 干式运输罐中送至 SCSA 诊断实验室。（3） 使用证明 DNA 完整性异质性（例如，15% DNA 片段化指数 [DFI]）的人类射精样品作为内标参考。 4. 流式细胞仪设置 注意：在启动流式细胞仪之前，应进行仪器的系统检查以验证分析性能。完成并通过所有检查后运行示例。 打开流式细胞仪软件并启动流式细胞仪。 收集示例数据。首先，将对照样品加载到流式细胞仪上，然后单击“运行”开始数据收集（如果需要，调整设置）。等待仪器开始抽吸样品，并提供检测到的事件的实时预览。注：对照样品：精子凋亡的阴性对照（未染色的精子细胞）;MMP 阳性对照（CCCP 处理的细胞）;SCSA 的参考示例。 创建用于查看数据的点图，并选择 x/y 轴参数（如 FSC、SSC）和线性以指定显示数据。选择并应用多边形门来描绘精子群体以进行分析，以便仪器实时绘制检测到的事件。 分析区域内的精子事件。对于精子凋亡，将 FL1 设置为 x 轴，将 FL2 设置为 x 轴。要分离活细胞、凋亡细胞或坏死细胞，请点击并拖动象限门，将精子群细分为四个特定群。 对于 MMP，将 FL1 设置为 x 轴，将 FL2 设置为 y 轴。创建一个多边形门，将精子群细分为两个特定的群。 对于 SCSA，将 FL4 设置为 x 轴（红色荧光，125/1,024 个流式细胞术通道），将 FL1 设置为 y 轴（绿色荧光，475/1,024 个流式细胞术通道）。以 45° 角绘制门以排除蜂窝碎片信号。 设置运行限制以指示何时停止收集数据。计算每个样本总共 10,000 个精子细胞，用于精子凋亡、MMP 和 SCSA 分析。 根据细胞数量设置液流速率（慢速、中速和快速，或自定义液流速率）。注：对于SCSA分析，要确定精子浓度，请解冻冷冻的原始样品并在FCM上运行。如果流速为 >250/s，则将样品稀释至正确的流速。独立测量所有样品两次，并计算平均值。每测量 10-15 个样品时，对参考样品进行测试，以确保仪器日常的标准化和稳定性。 设置阈值以消除细胞样品中的碎屑和噪声。将这些设置应用于实验中的所有样品。 如果需要，设置颜色补偿以校正荧光溢出。 在将样品加载到流式细胞仪上之前，轻轻地反移样品，为样品命名，然后运行样品。 运行完所有样品后，通过为样品数据指定文件名，将样品数据另存为 FCS 文件，以便进一步进行软件分析。保存当前试验的工作模板，以便在将来的运行中检索（可选）。 5. 数据分析 将数据导入流式细胞仪的数据分析软件（参见 材料表）。 双击 工作区中的第一个示例。等待 图形 窗口打开，显示沿 FSC 与 SSC 参数的事件图。创建一个门，隔离门中包含的精子群体，从父事件集中产生一个“子”群体。 在门控区域内双击，然后打开一个仅包含精子事件的新 图形 窗口。设置 x 轴和 y 轴参数以选择荧光通道。 选择 “浇口” 工具。在图中单击以显示门，以便创建的门隔离不同的细胞群。 右键单击（或按住 Control 单击）任何突出显示的行，然后选择“ 将分析复制到组”。将门控树应用于组内的所有样品。 保存并导出数据表。