ヒト精子の機能異常を検出するためのバイオマーカーのフローサイトメトリー解析
Summary
本プロトコルは、単一のサイトメーターでヒト精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位、およびDNA損傷の測定を可能にする実用的なソリューションを提供します。
Abstract
従来の精液パラメータ分析は、男性の生殖能力を評価するために広く使用されています。しかし、研究によると、不妊症患者の~15%は、従来の精液パラメータに異常を示さないことがわかっています。特発性不妊症を説明し、微妙な精子の欠陥を検出するには、追加の技術が必要です。現在、精子のアポトーシス、ミトコンドリア膜電位(MMP)、DNA損傷などの精子機能のバイオマーカーは、精子の生理機能を分子レベルで明らかにし、男性の生殖能力を予測することができます。
フローサイトメトリー(FCM)技術では、ヒト精液サンプルでこれらのマーカーを迅速、正確、正確に測定できますが、すべてのバイオマーカーを1台のサイトメーターで検査する必要がある場合、時間コストが大幅に増加し、結果が妨げられる可能性があります。このプロトコルでは、液化のために37°Cで収集および即時インキュベートした後、精液サンプルは、アネキシンV-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)/ヨウ化プロピジウム(PI)染色を使用して精子のアポトーシスについてさらに分析されました。MMPを5,5′,6,6′-テトラクロロ-1,1′,3,3′-テトラエチル-ベンズイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物(JC-1)プローブで標識し、アクリジンオレンジ(AO)染色による精子クロマチン構造アッセイ(SCSA)を用いてDNA損傷を評価しました。したがって、精子機能マーカーのフローサイトメトリー解析は、不妊症の診断とベンチとベッドの両方での精子機能の評価のための実用的で信頼性の高いツールキットとなり得ます。
Introduction
不妊症は公衆衛生上の問題となっており、男性不妊症は全症例の40%〜50%を占めています1,2。従来の精液の質分析は、男性の生殖能力を決定する上で重要な役割を果たしますが、不妊症患者の約15%は、精子数、運動性、形態などの精子パラメータが正常です3。さらに、定期的な精子検査は再現性が低く、精子機能に関する情報が限られており、男性の生殖能力を正確に評価したり、精子の微妙な欠陥を反映したりすることができません。精子機能をテストするために、ヘミゾナアッセイ(HZA)、精子浸透アッセイ、低浸透圧腫脹試験、抗精子抗体検査など、複数の技術が開発されていますが、これらの方法は時間がかかり、オペレーターの主観的な影響を受けやすいです。そのため、精子機能解析のための迅速かつ正確な手法の開発が必要です。
FCMは、1970年代に開発された高速シングルセル解析技術で、細胞生物学や医学の様々な分野で広く利用されています。FCMは、特異的蛍光プローブで標識された精子を解析する精子機能評価のための堅牢なツールである4。精子はシングルチャンネルまたはマルチチャンネルのレーザーを通過し、レーザービームによって散乱光と放出された蛍光が生成されます。散乱光には、前方散乱光(FSC)と側方散乱光(SSC)があり、テストされたセルのサイズとセルの粒度または内部構造を反映します。これらの信号は、コンピュータシステムによって収集、表示、分析され、その結果、精子からの一連の特性が迅速かつ正確に測定されます。したがって、FCMは、精子分析の分野でますます注目を集めている、迅速で客観的、多次元、およびハイスループットの手法です。FCMの適用は、従来の方法の欠点を補うことができ、精子の内部構造と機能を検出するための新しいアプローチを提供します。
精子のアポトーシスは男性の生殖能力と密接に関連しています5.精子のアポトーシスの検出は、精子の機能を分子レベルで評価するための重要な指標です。FCMは、アネキシンV-FITC/PI染色を用いて精子のアポトーシスを検出するための信頼性が高く高感度な方法として広く認識されています。基本原理は、ホスファチジルセリン(PS)がアポトーシスの初期段階で細胞膜の内層からその外層に移動することです。アネキシンVは、PSに対して高い親和性を有するCa2+依存性リン脂質タンパク質(通常FITCによって標識される)であり、したがって、細胞膜の外表面に露出したPSを検出する6。壊死とアポトーシスは、Pl染色と組み合わせて区別できます。したがって、アネキシンV-FITC/PI二重染色の方法は、異なるアポトーシス精子細胞を迅速、シンプル、かつ簡単に検出できるため、広く使用されています。
成熟した哺乳類の精子には約72〜80個のミトコンドリア7が含まれており、精子のミトコンドリア8が保持される生物学的理由が示唆されている。精子のミトコンドリアは、精子の運動性と生殖能力の維持に重要な役割を果たすことがわかっています9。JC-1染色は、様々な細胞タイプでMMPの指標として使用でき、精子のミトコンドリア活性評価に最もよく使用される蛍光色素の1つである10。JC-1は、ミトコンドリアに電位依存的に蓄積するカチオン性色素です。JC-1は525 nm(緑)で最大蛍光を発し、高電位(ΔΨm、80-100 mV)の膜に結合するとJ凝集体11を形成し、蛍光発光が~590 nm(橙赤)にシフトします。その結果、精子のミトコンドリアの脱分極は赤/緑の蛍光強度比の低下によって示され、FCMを使用してヒト精液サンプル中のMMPレベルを検出できます。
SCSA法は、Evensonらによって発明され12、1,024×1,024チャンネルスケールで独自のデュアルパラメータデータ(赤色蛍光と緑色蛍光)を使用した正確で再現性のあるテストと見なされています13。損傷した精子では、精子核のDNAと変化したタンパク質がAOによって標識され、DNA鎖の切断は赤色蛍光によって測定され、無傷の二本鎖はFCMで緑色の蛍光を発します14。今日では、精子DNAの完全性を推定するために多くの方法が開発されています。しかし、SCSAとは異なり、これらのアッセイはしばしば労働集約的であり、男性不妊症を診断する能力に欠けています。SCSA検査の結果は、ヒトのDNA妊娠および流産と有意に相関しており、SCSAがヒト精液分析に有用である可能性があるという説得力のある証拠を提供し、不妊症の臨床医にとって貴重なツールとして役立つ可能性があります15。
クロマチンの完全性、MMP、およびアポトーシスは、精子機能のさまざまな側面を反映しているため、これらのバイオマーカーの組み合わせにより、精子の状態に関するより包括的な洞察が得られる可能性があります。FCMは、ヒト精液検体中のクロマチン完全性、MMP、またはアポトーシスのいずれかを個別に測定するために使用できます。FCMの費用と染料のコストは、リプロダクティブヘルスのための臨床検査室でのこれらの技術の幅広い適用を制限してきましたが、繁殖力推定のためのそれらの価値は受け入れられています。
しかし、いずれの実験も精子サンプルの前処理が必要であり、前処理したサンプルはできるだけ早く検査する必要があるため、1つのFCMで3つのバイオマーカーを同時に測定すると、一部の実験の待ち時間が長くなり、結果の信頼性が損なわれる可能性があります。これは、3つの実験すべてを考慮してプロトコルが適切に配置されていない場合、待機プロセス中に精子が追加の損傷を受けるためです。この論文では、長い待ち時間によって引き起こされる実験品質を大幅に損なうことなく、1回のサイトメトリーで3つのバイオマーカーすべてを流暢に測定することを実現するプロトコルを提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト精子のクロマチン完全性、MMP、およびアポトーシスは、生殖転帰の貴重な予測因子であることがわかっています。ヒト精液の検査と処理に関する最新のWHO検査マニュアル(第6版)も、精子数などの日常的なパラメータの基本的な検査を超えた拡張検査として、これらの指標のいくつか(クロマチンの完全性とアポトーシス)を強調しています18。最近の出版物はまた、これらの指標が外部の有害暴露に対する反応のより敏感なマーカーである可能性があることを示唆しており、早期段階で生殖障害を特定する可能性を示しています19,20。これらの指標を定期的な検査と組み合わせることで、精子機能障害のプロファイルと集団における男性の生殖障害の複雑さについて、より包括的な理解が得られる可能性があります。
FCMによる精子分析の成功を大きく左右するいくつかの重要な問題があります。まず、精子のMMPとアポトーシスの測定は、精液が液化した後、すぐに検査する必要があります。時間コストを最小限に抑えるために、MMPの前処理とサンプルのアポトーシス分析を2人の技術者が別々に担当することができます。アポトーシスの前処理は単純であるため、MMP解析よりも早くフローサイトメトリーステップに移行します。SCSA分析では、液化後、新鮮な精液サンプルが利用可能になり次第、直ちに凍結保存する必要があります。精子サンプルは、液体窒素中で比較的長期間保存することができ、すぐに検査する必要はありません。
したがって、実験の現場時間コストは、MMP分析の期間と精子分析のフローサイトメトリーステップである40分に圧縮できます。次に、フローサイトメトリープラットホームでのゲーティングの設定は、サンプルのバッチごとに個別に決定する必要があります。散布図にクリアセルサブグループを持つ精子サンプルを、ゲーティング領域を描画するための参照として選択できます。第三に、この実験の指標には広く受け入れられている臨床的基準値がないため、過去の結果は品質管理の重要なツールとして使用できます。ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、特にSCSAとMMPの場合、測定の各バッチで設定することも推奨されます。
ここで提供される精子分析の代表的な結果は、Accuri C6を使用して導き出されます。ただし、この手法は、マイナーな変更で他の商用プラットフォームに適用できます。通常、すべての指標の測定要件を満たすには、合計5×106 個の精子細胞が必要です。サンプルの精子濃度が平均レベルよりもはるかに低い場合、精液の量の必要性が増加します。
通常の精子パラメータと同様に、ヒト精子のクロマチン完全性、MMP、およびアポトーシスにも顕著な個人内変動があります21。したがって、異なる時期に収集されたサンプルの複数のテストは、精子機能の損傷レベルのより正確な推定を提供する可能性があります。フローサイトメトリー分析の精子サンプリングの前に推奨される禁欲期間はありませんが、WHOによる定期的な精子分析に提案されている2〜7日間の射精禁が採用される場合があります。これは、検査室間および同じ男性から収集された異なるサンプル間での結果の比較可能性を向上させるのに役立つ可能性があります。
この方法の主な制限は、テストされた3つのバイオマーカーのうち2つ(アポトーシスとミトコンドリア膜電位)が新鮮な精液サンプルを必要とすることです。これにより、精液サンプルを検査室に提供できる男性に限定される可能性があります。DNA損傷(SCSA)の検査では、実験前に参照サンプルを調製してフローサイトメーターを校正する必要があります。注目すべきは、本プロトコルの適用にはラボでのFCM機器が必要であり、これは多くの臨床検査室にとって依然としてかなりの課題であるが、一部の地域ではサードパーティサービスとの協力が代替の選択肢となる可能性がある。
さらに、染料やその他の試薬の費用も、検査を必要とする可能性のある男性にとって経済的要因です。最後に、異なるブランドまたはバージョンのFCMを使用してバイオマーカーを調べる場合、プロトコルの変更が必要になることがあります。要約すると、この論文は、単一のフローサイトメトリーマシンによってヒト精子損傷の3つのバイオマーカーを推定するための実用的なアプローチを提示します。これは、男性のリプロダクティブヘルスに関する貴重な情報を提供し、定期的な精子検査を補完する可能性があります。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ご協力いただいたフィールドワーカーの皆様、取材にご協力いただいた方々に感謝いたします。
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
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