ניתוח ציטומטרי של זרימה של סמנים ביולוגיים לאיתור פגמים תפקודיים בזרע אנושי
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מספק פתרון מעשי המאפשר מדידה של אפופטוזיס, פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ונזק לדנ”א בזרע אנושי באמצעות ציטומטר יחיד.
Abstract
ניתוח פרמטר הזרע הקונבנציונאלי נמצא בשימוש נרחב להערכת פוריות הגבר. עם זאת, מחקרים מצאו כי ~ 15% מהחולים העקרים אינם מראים חריגות בפרמטרים הזרע הקונבנציונליים. יש צורך בטכנולוגיות נוספות כדי להסביר את אי הפוריות האידיופתית ולזהות פגמים עדינים בזרע. כיום, סמנים ביולוגיים של תפקוד הזרע, כולל אפופטוזיס זרע, פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) ונזק לדנ”א, חושפים פיזיולוגיה של הזרע ברמה המולקולרית ומסוגלים לחזות את פוריות הגבר.
בעזרת טכניקות של ציטומטריית זרימה (FCM), כל אחד מהסמנים הללו יכול להימדד במהירות, במדויק ובמדויק בדגימות זרע אנושיות, אך עלויות הזמן גדלות באופן משמעותי והתוצאות עלולות להיחסם אם כל הסמנים הביולוגיים צריכים להיבדק עם ציטומטר יחיד. בפרוטוקול זה, לאחר איסוף ודגירה מיידית ב 37 מעלות צלזיוס להנזלה, דגימות זרע נותחו עוד יותר עבור אפופטוזיס זרע באמצעות צביעת Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI). ה-MMP סומן בבדיקה 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1), ונזק לדנ”א הוערך באמצעות בדיקת מבנה כרומטין זרע (SCSA) עם צביעת כתום אקרידין (AO). לפיכך, ניתוח ציטומטרי זרימה של סמני תפקוד זרע יכול להיות ארגז כלים מעשי ואמין לאבחון אי פוריות והערכת תפקוד הזרע הן בספסל והן במיטה.
Introduction
אי פוריות הפכה לבעיה בבריאות הציבור, כאשר אי פוריות הגבר תורמת ל 40%-50% מכלל המקרים 1,2. למרות שניתוח איכות זרע קונבנציונלי ממלא תפקיד חשוב בקביעת פוטנציאל פוריות הגבר, לכ -15% מהחולים עם אי פוריות יש פרמטרים זרע נורמליים כגון ספירת זרע, תנועתיות ומורפולוגיה3. יתר על כן, בדיקות זרע שגרתיות הן בעלות יכולת חזרה ירודה, מספקות מידע מוגבל על תפקוד הזרע ואינן יכולות לתת הערכה מדויקת של פוריות הגבר או לשקף את הפגמים העדינים של הזרע. טכניקות רבות פותחו לבדיקת תפקוד הזרע, כגון בדיקת המיזונה (HZA), בדיקת חדירת הזרע, בדיקת הנפיחות ההיפו-אוסמוטית, בדיקת נוגדני האנטי-זרע, אך שיטות אלה גוזלות זמן ופגיעות להשפעות סובייקטיביות של המפעילים. לכן, יש צורך לפתח שיטות מהירות ומדויקות לניתוח תפקודי זרע.
FCM היא טכנולוגיית אנליזה מהירה של תא בודד שפותחה בשנות השבעים, אשר נמצאת בשימוש נרחב בתחומים שונים של ביולוגיה של התא ורפואה. FCM הוא כלי חזק להערכת תפקוד הזרע המנתח זרעונים המסומנים בבדיקת פלואורסצנטיות ספציפית4. הזרעונים עוברים דרך לייזרים חד-ערוציים או רב-ערוציים, ואור מפוזר ופלואורסצנטיות הנפלטת מיוצרים על ידי קרן לייזר. האור המפוזר כולל אור מפוזר קדימה (FSC) ואור מפוזר צדדי (SSC), המשקף את גודל התא הנבדק ואת גרעיניות התא או המבנה הפנימי שלו. אותות אלה נאספים, מוצגים ומנותחים על ידי מערכת המחשב, וכתוצאה מכך סדרה של מאפיינים מהזרעונים נמדדים במהירות ובדייקנות. לכן, FCM היא טכניקה מהירה, אובייקטיבית, רב-ממדית ובעלת תפוקה גבוהה שזכתה לתשומת לב גוברת בתחום ניתוח הזרע. היישום של FCM יכול לפצות על חסרונות בשיטות מסורתיות ומספק גישה חדשה לזיהוי המבנה הפנימי והתפקוד הפנימי של הזרע.
אפופטוזיס זרע קשור קשר הדוק לפוריות הגבר5. זיהוי אפופטוזיס זרע הוא מדד חשוב להערכת תפקוד הזרע ברמה המולקולרית. FCM מוכרת באופן נרחב כשיטה אמינה ורגישה לזיהוי אפופטוזיס זרע באמצעות צביעת V-FITC/PI של Annexin. העיקרון הבסיסי הוא שפוספטידיל-סרין (PS) מועבר מהשכבה הפנימית של קרום התא לשכבה החיצונית שלו בשלב המוקדם של אפופטוזיס. Annexin V הוא חלבון פוספוליפיד תלוי Ca2+ (בדרך כלל מסומן על ידי FITC) שיש לו זיקה גבוהה ל- PS, ובכך מזהה PS שנחשף לפני השטח החיצוניים של קרום התא6. נמק אפופטוזיס ניתן להבחין בשילוב עם צביעת Pl. לכן, השיטה של צביעה כפולה Annexin V-FITC/PI נמצאת בשימוש נרחב, מכיוון שהיא מהירה, פשוטה וקלה לזיהוי תאי זרע אפופטוטיים שונים.
זרע יונק בוגר מכיל כ-72-80 מיטוכונדריה7, מה שמרמז על סיבה ביולוגית לשימור מיטוכונדריהשל זרע 8. מיטוכונדריה של זרע נמצאו כממלאים תפקידים חשובים בשמירה על תנועתיות ופוריות הזרע9. כתם JC-1, שיכול לשמש אינדיקטור של MMP במגוון סוגי תאים, הוא אחד הפלואורוכרום הפופולריים ביותר להערכת פעילות מיטוכונדריאלית של זרע10. JC-1 הוא צבע קטיוני שמצטבר במיטוכונדריה באופן תלוי פוטנציאל. ל-JC-1 יש פליטה פלואורסצנטית מקסימלית של 525 ננומטר (ירוק) והוא יוצר J-אגרגטים 11 כאשר הוא נקשר לממברנות בעלות פוטנציאל גבוה (ΔΨm, 80-100 mV), וכתוצאה מכך משתנה פליטת הפלואורסצנטיות ל~590 ננומטר (כתום-אדום). כתוצאה מכך, דפולריזציה מיטוכונדריאלית של זרע מסומנת על ידי ירידה ביחס עוצמת הפלואורסצנטיות האדומה/ירוקה, וניתן להשתמש ב- FCM כדי לזהות רמות MMP בדגימות זרע אנושיות.
מתודולוגיית SCSA הומצאה על ידי Evenson et al.12, והיא נחשבת לבדיקה מדויקת וחוזרת עם נתוני פרמטרים כפולים ייחודיים (פלואורסצנטיות אדומה לעומת ירוקה) בקנה מידה 1,024 × 1,024 ערוצים 13. בזרע פגום, DNA וחלבונים שהשתנו בגרעיני זרע מסומנים על ידי AO, ושברים של גדיל הדנ”א נמדדים על ידי פלואורסצנטיות אדומה, בעוד שגדילים כפולים שלמים פולטים פלואורסצנטיות ירוקה ב- FCM14. כיום, שיטות רבות פותחו כדי להעריך את שלמות ה- DNA של הזרע. עם זאת, שלא כמו SCSA, בדיקות אלה הן לעתים קרובות עתירות עבודה וחסרות את היכולת לאבחן פוריות הגבר. תוצאות בדיקת SCSA תואמות באופן משמעותי הריון והפלות DNA אנושי, מספקות ראיות משכנעות לכך ש- SCSA עשוי להיות שימושי בניתוח זרע אנושי, ועשוי לשמש כלי רב ערך לקלינאי פוריות15.
שלמות הכרומטין, MMP ואפופטוזיס משקפים היבטים שונים של תפקוד הזרע, ולכן, השילוב של סמנים ביולוגיים אלה עשוי לספק תובנה מקיפה יותר לגבי מצב הזרע. ניתן להשתמש ב-FCM למדידות נפרדות של שלמות הכרומטין, MMP או אפופטוזיס בדגימות זרע אנושיות. למרות שההוצאות של FCM ועלות הצבעים הגבילו את היישום הרחב של טכניקות אלה במעבדות קליניות לבריאות הרבייה, הערך שלהן להערכת פריון מתקבל.
עם זאת, מכיוון שכל אחד מהניסויים דורש טיפול מקדים בדגימות זרע, וכל הדגימות שטופלו מראש צריכות להיבדק בהקדם האפשרי, מדידה בו זמנית של כל שלושת הסמנים הביולוגיים עבור דגימה עם FCM יחיד עלולה להוביל לזמן המתנה ארוך לחלק מהניסויים ולשבש את אמינות התוצאות. הסיבה לכך היא שהזרע מקבל נזק נוסף במהלך תהליך ההמתנה, אם הפרוטוקול אינו מסודר כראוי תוך התחשבות מוחלטת בכל שלושת הניסויים. מאמר זה מציג פרוטוקול המממש מדידה שוטפת של כל שלושת הסמנים הביולוגיים בציטומטריה אחת ללא פשרה משמעותית באיכות הניסוי הנגרמת על ידי זמני המתנה ממושכים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלמות הכרומטין, MMP ואפופטוזיס של זרעונים אנושיים נמצאו כמנבאים בעלי ערך לתוצאות רבייה. מדריך המעבדה האחרון של ארגון הבריאות העולמי לבדיקה ועיבוד של זרע אנושי (מהדורה שישית) הדגיש גם כמה אינדיקטורים אלה (שלמות הכרומטין ואפופטוזיס) כבדיקות מורחבות מעבר לבדיקה הבסיסית של פרמטרים שגרתיים כגון ספירת זרע18. פרסומים אחרונים מצביעים גם על כך שאינדיקטורים אלה עשויים להיות סמנים רגישים יותר של תגובה לחשיפות מסוכנות חיצוניות, דבר המצביע על הפוטנציאל שלהם לזיהוי נזקי רבייה בשלב מוקדם יותר19,20. שילוב אינדיקטורים אלה עם בדיקות שגרתיות עשוי גם לספק הבנה מקיפה יותר על הפרופיל של תפקוד לקוי של זרע ואת המורכבות של נזק הרבייה הגברית באוכלוסייה.
ישנם מספר נושאים מרכזיים הקובעים באופן משמעותי את הצלחת ניתוח הזרע עם FCM. ראשית, מדידת MMP זרע ואפופטוזיס דורשת בדיקה מיידית לאחר נוזלי הזרע. כדי למזער את עלות הזמן, שני טכנאים יכולים בנפרד לקחת אחריות על הטיפול המקדים של MMP וניתוח אפופטוזיס של דגימה. מכיוון שהטיפול המקדים באפופטוזיס פשוט יותר, הוא יעבור לשלב הציטומטרי של הזרימה מהר יותר מניתוח MMP. לצורך ניתוח SCSA, דגימות זרע טריות צריכות להישמר בהקפאה מיד עם זמינותן לאחר הנזלה. לאחר מכן ניתן לאחסן את דגימות הזרע בחנקן נוזלי לתקופה ארוכה יחסית ואינן זקוקות לבדיקה מיידית.
בהתאם לכך, ניתן לדחוס את עלות הזמן באתר של הניסוי ל -40 דקות, שהוא משך ניתוח MMP בתוספת השלב הציטומטרי של הזרימה של ניתוח הזרע. שנית, יש להחליט על הגדרת הגאטינג בפלטפורמה הציטומטרית של הזרימה עבור כל אצווה של דגימות בנפרד. ניתן לבחור את דגימות הזרע עם תת-קבוצות תאים ברורות בחלקת הפיזור כהפניה לציור אזור הגאט. שלישית, מכיוון שאין ערכי ייחוס קליניים מקובלים לאינדיקטורים של ניסוי זה, תוצאות היסטוריות עשויות לשמש ככלי חשוב לבקרת איכות. מומלץ גם להגדיר בקרות חיוביות ושליליות בכל אצווה של מדידות, במיוחד עבור SCSA ו- MMP.
התוצאות המייצגות של ניתוח הזרע המובאות כאן נגזרות באמצעות Accuri C6. עם זאת, הטכניקה יכולה להיות מיושמת על פלטפורמות מסחריות אחרות עם שינוי קל. בדרך כלל, יהיה צורך בסך הכל 5 × 106 תאי זרע כדי לעמוד בדרישה למדידת כל המדדים. אם ריכוז הזרע של דגימה נמוך בהרבה מהרמה הממוצעת, הצורך בנפח הזרע יגדל.
בדומה לפרמטרים שגרתיים של זרע, קיימת גם שונות תוך אישית ניכרת בשלמות הכרומטין, MMP ואפופטוזיס של זרעונים אנושיים21. בהתאם לכך, בדיקות מרובות של דגימות שנאספו בזמנים שונים עשויות לספק הערכה מדויקת יותר של רמת הנזק לתפקוד הזרע. למרות שאין תקופת התנזרות מומלצת לפני דגימת זרע לניתוח ציטומטרי זרימה, ניתן לאמץ 2-7 ימים של התנזרות משפיכה, המוצעת לניתוח זרע שגרתי על ידי ארגון הבריאות העולמי. זה עשוי לעזור לשפר את ההשוואה של התוצאות בין מעבדות ובין דגימות שונות שנאספו מאותם גברים.
מגבלה עיקרית של שיטה זו היא ששניים מתוך שלושת הסמנים הביולוגיים שנבדקו – אפופטוזיס ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית – דורשים דגימות זרע טריות. זה עשוי להגביל את היישום שלהם לגברים שיכולים לספק דגימות זרע למעבדה. לבדיקת נזק לדנ”א (SCSA), יש להכין דגימות ייחוס לפני הניסוי כדי לכייל את ציטומטר הזרימה. יש לציין כי יישום הפרוטוקול הנוכחי דורש מכשיר FCM במעבדה, שעדיין מהווה אתגר משמעותי עבור מעבדות קליניות רבות, אם כי שיתוף פעולה עם שירות צד שלישי עשוי להיות בחירה חלופית באזורים מסוימים.
בנוסף, ההוצאה של הצבעים וריאגנטים אחרים היא גם גורם כספי עבור גברים שעשויים להזדקק לבדיקה. לבסוף, ייתכן שיהיה צורך לשנות את הפרוטוקול אם נעשה שימוש במותגים או גרסאות שונות של FCM כדי לבחון את הסמנים הביולוגיים. לסיכום, מאמר זה מציג גישה מעשית להערכת שלושה סמנים ביולוגיים של נזק לזרעונים אנושיים על ידי מכונת ציטומטריית זרימה יחידה. זה עשוי לספק מידע חשוב על בריאות הרבייה הגברית ולהשלים את בדיקת הזרע השגרתית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל עובדי השטח על עזרתם ולמרואיינים על שיתוף הפעולה.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
