Una detección multiplexada de alto rendimiento para diabetes tipo 1, enfermedades celíacas y COVID-19

El protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional Múltiple de Colorado. 1. Preparación del tampón Prepare el tampón de etiquetado (2x PBS, pH 7.9): Agregue 100 ml de 10x PBS a 400 ml de agua destilada y ajuste el pH usando NaOH a 7.9. Hacer 3 mM de biotina y Ru Sulfo-NHS: Disuelva 1 mg de biotina en 588 μL de tampón de etiquetado y disuelva 150 nmol de Ru Sulfo-NHS en 50 μL de tampón de etiquetado. Preparar el tampón antígeno (BSA al 1%): Disolver 5 g de albúmina sérica bovina (BSA) en 500 mL de 1x PBS. Prepare el tampón de recubrimiento (3% Bloqueador A): Disuelva 15 g de Bloqueador A en 500 ml de 1x PBS. Preparar el primer tampón de lavado (0,05 % Tween 20, PBST): Mezclar 2,5 ml de Tween 20 en 5.000 ml de 1x PBS. Prepare el segundo tampón de lavado (0,4 M NaCl): Mezcle 50 ml de 5 M NaCl en 575 ml de agua destilada para hacer la solución de 0,4 M NaCl.NOTA: Para un etiquetado eficiente, siempre use soluciones de biotina recién preparadas y Ru Sulfo-NHS y no almacenadas hechas previamente. 2. Etiquetado de proteínas de antígeno con biotina y Ru Sulfo-NHS por separado NOTA: Se recomienda una mayor concentración de proteína antígeno ≥0.5 mg / ml para una mayor eficiencia de etiquetado. Prepare seis soluciones de proteínas de antígeno dirigidas, incluyendo proinsulina, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG y dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Calcular los moles de cada antígeno proteico según su peso molecular y hacer proporciones molares apropiadas de biotina o Ru Sulfo-NHS. La relación entre el antígeno y la suma de biotina o Ru Sulfo-NHS será de 1:5 para antígenos moleculares pequeños (peso molecular ≤10 kd), como la proteína proinsulina. Para antígenos moleculares medios (peso molecular 10-50 kd), como ZnT8, la relación se ajustará a 1:10. Para antígenos de gran peso molecular (peso molecular >50 kd), como GAD, la relación molar será de 1:20. Divida la proteína antígeno en dos partes iguales y mézclela por separado con biotina y Ru Sulfo-NHS utilizando la relación molar calculada en el paso 2.1. Incubar la mezcla a temperatura ambiente (RT) durante 1,5 h, evitando la luz.NOTA: Todos los productos químicos reductores, como el Tris o la glicina, en el tampón de la proteína antígeno, deben eliminarse mediante una columna de espín de tamaño preparada con un tampón de 2x PBS (pH 7.9). Prepare las columnas de espín con 2x PBS (el tamaño de la columna de espín, 2 ml o 5 ml, depende del volumen de la proteína del antígeno de marcado): agregue 1 ml de tampón PBS 2x a la columna de espín, centrifugarla a 1,000 x g durante 2 min y repita el paso 2 veces más. Deje que el antígeno proteína-biotina o la mezcla -Ru Sulfo-NHS pase a través de la columna de centrifugado 1x (centrifugar la columna a 1,000 x g durante 2 min) para purificar y detener la reacción de etiquetado. Mida el volumen final de la proteína de antígeno marcada eluida de las columnas de espín, calculando las concentraciones de proteína de antígeno marcada con biotina o Ru Sulfo-NHS. Hacer alícuotas más pequeñas de proteína antígeno marcada (50 μL/tubo) y almacenarlas a -80 °C para su uso a largo plazo.NOTA: La cobertura de proteína después de cada columna de espín será una tasa de retención aproximada del 90% al 95%. 3. Definir la mejor concentración y proporciones para antígenos marcados con biotina y Ru Sulfo-NHS para el ensayo 6-Plex ECL (ensayo de tablero de ajedrez) NOTA: El ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno es necesario antes de la integración en el ensayo multiplexado. Aplique el ensayo de tablero de ajedrez para cada antígeno por separado.NOTA: Pasos 3.2.-3.7. usará TGA como un breve ejemplo. El proceso de ensayo de tablero de ajedrez TGA es simular el proceso de ensayo pero con un solo tipo de antígeno. Realice la dilución en serie de la tTG biotinilada y la tTG marcada con Ru Sulfo-NHS. Las concentraciones de trabajo recomendadas de la primera solución de mezcla comienzan a partir de 240 ng / ml para tTG biotinilada y marcada con Ru Sulfo-NHS. Supongamos que las concentraciones de tTG original biotinilado y marcado con Ru Sulfo-NHS son 1.0 μg / μL. Haga una dilución 10x del tTG original marcado con Ru Sulfo-NHS y una dilución 5x del tTG biotinilado original con 5% de BSA. Mezclar 4 μL de proteína tTG biotinilada con 156 μL de BSA (tampón antígeno) al 5% y 240 μL del enlazador conjugado con estreptavidina en un tubo e incubar la solución en RT durante 30 min. Luego, agregue 160 μL de solución de parada e incube a RT durante otros 30 minutos. Tome 400 μL de la mezcla y mezcle con 2 ml de solución de parada. La concentración del tTG biotinilado en la mezcla es de 240 ng/mL. Para hacer una dilución seriada para el antígeno ZnT8 marcado con biotina, prepare otros cinco tubos nuevos, tome 1 ml de una alícuota de la mezcla en el paso 3.3. y mezclar con 1 ml de solución de parada en un tubo nuevo, y obtener la mezcla con una concentración de 120 ng / ml. Repita este paso, haga diluciones seriadas 1: 1 y obtenga el tTG marcado con biotina a 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml y 7.5 ng / ml. Agregue 4 μL de tTG marcado con Ru Sulfo-NHS con 1.6 ml de solución de parada y obtenga una mezcla de tTG marcado con Ru Sulfo-NHS a una concentración de 240 ng / ml. Con los mismos pasos de 3.4., haga diluciones seriadas 1: 1 y obtenga el antígeno ZnT8 marcado con Ru Sulfo-NHS a 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7.5 ng / ml y 3.75 ng / ml. La última concentración es de 0 ng / ml, con solo solución de parada y sin antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS. Preparar muestras de suero de control positivo y control negativo de tTG (precalificadas y estandarizadas por un solo ensayo de tTG ECL) y una placa de PCR de 96 pocillos. Alícuota las muestras de suero control positivo y negativo en la mitad izquierda y mitad derecha de la placa, respectivamente, con 7 μL en cada pocillo. Agregue 1x PBS a la placa, con 33 μL por pocillo. En la mitad izquierda de la placa de PCR, agregue 24 μL de la solución de enlazador de tTG marcada con biotina diluida en serie a cada pocillo, una columna con una concentración en orden de mayor a menor. De la misma manera, agregue 16 μL del antígeno tTG marcado con Ru Sulfo-NHS diluido en serie a cada pocillo, una fila con una concentración, y luego mezcle bien. Repita el paso en la mitad derecha de la placa de PCR. Continuar con el resto de los pasos del ensayo descritos en los pasos 5.3.-9.1. hasta que se obtengan los datos brutos de conteo. Calcule las relaciones entre las señales de control positivo y las señales de control negativo correspondientes. Determine la mejor concentración para el antígeno marcado con biotina y el antígeno marcado con Ru Sulfo-NHS con valores de relación más altos y antecedentes más bajos para la muestra de control negativo. Las concentraciones óptimas de trabajo de biotina y proteína antígeno marcada con Ru Sulfo-NHS se muestran a continuación: 16.0 ng / ml y 8.0 ng / ml para GAD65, 18.8 ng / ml y 9.4 ng / ml para SARS-CoV-2 RBD, 42.0 ng / ml y 42.0 ng / ml para IA-2, 60.0 ng / ml y 60.0 ng / ml para tTG, 4.2 ng / ml y 4.2 ng / ml para ZnT8, y 31,3 ng/ml y 31,3 ng/ml para la proinsulina. 4. Crear una solución de antígeno acoplado al enlazador Diluir los antígenos marcados con biotina y Ru Sulfo-NHS con BSA al 5% hasta las concentraciones óptimas de trabajo de acuerdo con el paso 3.9. Unir enlazadores preseleccionados a cada proteína de antígeno biotinilado. Para un ensayo en placa de 96 pocillos, agregue 4 μL de GAD65 biotinilada, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y proteína antígeno de proinsulina en un tubo separado que contenga 156 μL de BSA al 1% y mezcle con 240 μL de los enlazadores conjugados con estreptavidina correspondientes 1, 2, 3, 8, 9 y 10 (Figura 1). Incubar la mezcla durante 30 min a RT. Alícuota 160 μL de solución de parada en cada tubo e incubar la mezcla a RT durante 30 min. Saque 400 μL de la solución de mezcla de cada tubo y combínelos. Agregue 4 μL de Ru Sulfo-NHS marcado con GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 y antígeno de proinsulina a la mezcla anterior, y luego agregue 1.6 ml de solución de parada y 3.2 ml de 1x PBS y mezcle. Ahora la solución de antígeno está lista para su uso en el ensayo. 5. Incubar muestras de suero con el antígeno marcado Alícuota 7 μL de suero por pocillo para una placa de PCR de 96 pocillos y cubrir con film de sellado. Precaliente el suero a 56 °C durante 30 min en una máquina de PCR. Centrifugar brevemente la placa a 100 x g durante 1 min. Añadir 63 μL de solución de antígeno (preparada en la etapa 4.4) por pocillo y mezclar con los sueros. Cubra la placa de PCR con una lámina de sellado para evitar la luz. Agitar la placa en una coctelera a 450 rpm a RT durante 2 h y, a continuación, incubar la placa a 4 °C durante 18-24 h. 6. Prepare la placa 6-Plex Tome una placa 6-Plex del refrigerador a 4 °C, permitiendo que la placa llegue a RT. Agregue 150 μL de bloqueador A al 3% a cada pocillo de la placa 6-Plex. Vuelva a colocar el plato en nevera a 4 °C, cubra el plato con papel de aluminio evitando la luz e incube durante la noche.NOTA: Los pasos del ensayo en el Día 1 incluyen las secciones 4.-6. 7. Transfiera el suero/antígeno incubado a la placa 6-Plex Al día siguiente, saque la placa de incubación 6-Plex del refrigerador y retire todo el amortiguador de la placa. Dé palmaditas en el plato sobre toallas de papel para que se seque. Lave la placa 6-Plex 3x con 150 μL de tampón de lavado por pocillo cada vez. Seque la placa en toallas de papel y el suero/antígeno alícuota se incuba de cada pocillo de la placa de PCR de incubación durante la noche en dos pocillos de la placa 6-Plex (30 μL por pocillo para duplicados). Cubra el plato con papel de aluminio, luego coloque el plato en un agitador de platos y agite con una velocidad de 450 rpm a RT durante 1 h. 8. Lave la placa 6-Plex y agregue un búfer de lectura Vierta la solución en la placa 6-Plex y lave la placa 3 veces con 150 μL de tampón de lavado de NaCl 0,4 M por pocillo cada vez. Después de completar el tercer lavado, seque la placa contra la toalla de papel y agregue 150 μL de tampón de lectura en cada pocillo.NOTA: Las burbujas de aire en el pozo afectan la precisión de la máquina lectora de placas y deben evitarse a toda costa. 9. Lee la placa y analiza los datos Cuente la placa en un analizador de electroquimioluminiscencia. Los resultados de la lectura se presentarán con los valores en recuentos por segundo (CPS). Calcular el índice de anticuerpos relativo de cada muestra utilizando el CPS bruto obtenido de la máquina lectora contra el CPS de los controles positivos y negativos estándar internos de cada anticuerpo específico (Valor del índice = [CPS (muestra) – CPS (estándar negativo)] / [CPS (estándar positivo) – CPS (estándar negativo)]). Determinar los resultados negativos o positivos de anticuerpos utilizando los valores de corte que se han establecido en los percentiles 99.5a 99.8 de 555 muestras de control negativo del estudio ASK (todas las muestras negativasde anticuerpos sin antecedentes o antecedentes familiares de diabetes o cualquier otro tipo de enfermedad autoinmune).NOTA: Los pasos del ensayo en el Día 2 incluyen las secciones 7-9.