使用真空稳定成像系统的实验性急性肺损伤中肺微循环的活体内宽视场荧光显微镜

活体显微镜（IVM）是一种有用的成像工具，用于可视化和研究 体内各种生物物理过程。肺 在体内 成像是非常具有挑战性的，因为它的封闭位置，其组织的脆弱性以及呼吸和心跳引起的运动伪影^1，2。已经开发了各种活体显微镜（IVM）装置，用于肺微循环中白细胞 – 内皮相互作用的实时成像，以克服这些挑战。这些方法基于手术暴露和稳定肺部以进行成像。

动物通常通过外科手术为肺病媒体移植做准备。首先，对动物进行插管和通气，这允许手术切除胸窗并随后进行干预以稳定肺部以进行成像。一种技术涉及将实质粘附在玻璃盖玻片³上，该过程可能会对成像组织造成重大的物理创伤。更先进的是利用真空系统在玻璃窗⁴下稳定肺部。这种设置有助于通过分布在大面积区域的可逆真空将肺表面松散地粘附到盖玻片上，并扩大肺，同时仍然限制x，y和z尺寸⁴的运动。真空通过围绕装置成像区域的通道均匀施加，并将组织拉入面向成像级盖玻片⁴的浅锥形区域。通过这个观察窗，可以使用各种光学成像方式研究肺微循环。

肺病媒体能对多种微循环参数进行定量成像。这些包括诸如白细胞轨迹速度和长度⁵，红细胞流速⁶和氧合⁷，肿瘤转移⁸，免疫细胞亚群^9，10，11的^区别，微粒的可视化¹²，肺泡动力学^13，14，血管通透性¹⁵和毛细血管功能¹⁶的测量.这里的重点是白细胞募集和毛细血管功能。肺微循环中白细胞募集的开始涉及白细胞和内皮细胞之间的瞬时滚动相互作用和牢固的粘附相互作用，两者在炎症条件下均增加^16，17。通常，滚动通过操作员定义的参考线的白细胞数量来量化，而粘附则通过内皮¹⁶上不动的白细胞数量来量化。毛细血管功能也可能在炎症状态下受到影响，通常导致灌注减少。这可以归因于几个因素，包括红细胞变形性的降低¹⁸和内皮细胞诱导的NO合酶的杂交表达导致病理性分流¹⁹。通常，测量每个区域灌注毛细血管的聚集长度，并将其报告为功能性毛细血管密度（FCD）。

实时研究肺部白细胞募集需要用荧光染料或荧光标记抗体标记生物靶标²⁰。或者，各种转基因小鼠菌株如溶菌酶M-green荧光蛋白（LysM-GFP）小鼠可用于对特异性免疫细胞亚群（如嗜中性粒细胞^21，22）进行成像。然后可以使用宽视场荧光显微镜，共聚焦显微镜或多光子显微镜观察荧光标记的白细胞。这些技术通过利用特定的激发波长和检测发射的荧光来实现对比度，同时阻断激发波长的检测，从而突出显示标记的物体。

关于小鼠肺白细胞滚动、粘附和功能毛细血管密度量化的现有研究主要依赖于手动视频分析。这是通过开源软件（如斐济^6，23）、专有软件（如CapImage¹²）或定制图像处理系统²⁴实现的。相反，各种专有软件平台（例如，NIS Element，Imaris，Volocity，MetaMorph）可以自动测量各种其他生理参数，包括前面提到的许多^5，6，⁷，^{8，9，10，11，12，13，15}。

关于使用肺病媒的急性肺损伤 （ALI） 和急性呼吸窘迫综合征 （ARDS） 的病理学，已经做出了重要的观察结果。ARDS的特征在于肺部的一系列病理生理过程，包括由内皮和上皮屏障²⁵功能障碍引起的肺水肿和肺泡损伤。使用小鼠模型，已经发现脓毒症诱导的ALI与肺环境中免疫细胞运输的显着有害变化有关²⁶。发现招募到脓毒症诱导的ALI小鼠毛细血管的嗜中性粒细胞阻碍微循环，从而增加ALI²⁶的缺氧。此外，IVM已被用于深入了解ARDS²⁷发作后的潜在修复机制。肺病媒综合防治也是了解各种阻塞性肺疾病病理生理学变化的宝贵工具。例如，囊性纤维化（CF）和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病中粘液运输的可视化促进了对粘液清除的新型和现有治疗方法的研究²⁸。这些条件下的白细胞运输也进行了分析¹⁷.

该协议扩展了Lamm等人最初描述的方法，^以 使用常规荧光显微镜研究白细胞 – 内皮相互作用。所描述的程序采用 体内 肺成像系统，其中包括16.5 cm x 12.7cm金属底座，显微操作器和真空成像窗口（图1）。该系统安装在20 cm x 23.5 cm的3D打印平台（补充文件1）中，为通风机管和加热垫提供安全连接。该方法为小鼠肺微循环 在体内提供了可重复和可量化的成像。详细解释了手术准备的重要方面以及真空稳定肺成像系统的正确利用。最后，利用ALI实验模型对改变的白细胞滚动、白细胞粘连和与炎症相关的毛细血管灌注进行有代表性的成像和分析。使用该方案应有助于进一步重要研究急性疾病状态下肺部微循环的病理生理学变化。