Summary

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Published: May 05, 2022
doi:

Summary

La respirometria ad alta risoluzione accoppiata a sensori di fluorescenza determina il consumo di ossigeno mitocondriale e la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il presente protocollo descrive una tecnica per valutare le frequenze respiratorie mitocondriali e la produzione di ROS nel nervo sciatico permeabilizzato.

Abstract

La disfunzione mitocondriale nei nervi periferici accompagna diverse malattie associate alla neuropatia periferica, che può essere innescata da molteplici cause, tra cui malattie autoimmuni, diabete, infezioni, disturbi ereditari e tumori. Valutare la funzione mitocondriale nei nervi periferici del topo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni del campione, di un numero limitato di mitocondri presenti nel tessuto e della presenza di una guaina mielinica. La tecnica descritta in questo lavoro minimizza queste sfide utilizzando un protocollo di permeabilizzazione unico adattato da quello utilizzato per le fibre muscolari, per valutare la funzione mitocondriale del nervo sciatico invece di isolare i mitocondri dal tessuto. Misurando la produzione di specie reattive fluorimetriche con Amplex Red/Peroxidase e confrontando diversi substrati e inibitori mitocondriali nei nervi permeabilizzati alla saponina, è stato possibile rilevare contemporaneamente gli stati respiratori mitocondriali, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e l’attività dei complessi mitocondriali. Pertanto, il metodo qui presentato offre vantaggi rispetto alla valutazione della funzione mitocondriale con altre tecniche.

Introduction

I mitocondri sono essenziali per mantenere la vitalità cellulare e svolgono numerose funzioni cellulari come il metabolismo energetico (vie metaboliche di glucosio, amminoacidi, lipidi e nucleotidi). Come sito primario della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), i mitocondri sono centrali in diversi processi di segnalazione cellulare come l’apoptosi e partecipano alla sintesi di cluster ferro-zolfo (Fe-S), all’importazione e alla maturazione delle proteine mitocondriali e al mantenimento del loro genoma e dei ribosomi 1,2,3. La rete dinamica della membrana mitocondriale è controllata da processi di fusione e fissione e dispone anche di macchinari per il controllo di qualità e mitofagia 4,5,6.

La disfunzione mitocondriale è associata alla comparsa di diverse condizioni patologiche come il cancro, il diabete e l’obesità7. Disturbi della funzione mitocondriale sono rilevati nelle malattie neurodegenerative che colpiscono il sistema nervoso centrale, come nel morbo di Alzheimer 8,9, nel morbo di Parkinson10,11, nella sclerosi laterale amiotrofica12,13 e nella malattia di Huntington 14,15 . Nel sistema nervoso periferico, la perdita della funzione mitocondriale negli assoni è osservata nelle neuropatie immunitarie, come la sindrome di Guillain-Barré16,17, e in associazione con un’elevata produzione di ROS mitocondriale negli assoni, questi eventi portano all’attivazione della MAP Chinasi nelle cellule di Schwann18. Ciò dimostra che la fisiologia mitocondriale può essere essenziale non solo per una cellula sito-specifica, ma per un intero tessuto. Nella polineuropatia sensoriale distale associata all’HIV (HIV-DSP), i mitocondri hanno un ruolo nel meccanismo attraverso il quale il trans-attivatore della proteina di trascrizione (HIV-TAT) consente all’HIV di replicarsi in modo efficiente, così come molti altri ruoli nella patogenesi dell’infezione da HIV19,20.

La valutazione della fisiologia mitocondriale del nervo sciatico è emersa come un obiettivo essenziale per lo studio della neuropatia 7,21,22. Nella neuropatia diabetica, le analisi proteomiche e metabolomiche suggeriscono che la maggior parte delle alterazioni molecolari nel diabete influenzano la fosforilazione ossidativa mitocondriale del nervo sciatico e il metabolismo lipidico7. Queste alterazioni sembrano anche essere i primi segni del diabete21 indotto dall’obesità. In un modello murino di neuropatia dolorosa indotta dalla chemioterapia, la compromissione mitocondriale nel nervo sciatico viene rilevata come una diminuzione della fosforilazione ossidativa22 e una riduzione delle attività dei complessi mitocondriali, del potenziale di membrana e del contenuto di ATP23. Tuttavia, sebbene diversi gruppi abbiano citato la disfunzione mitocondriale nelle neuropatie, questi studi sono limitati alle misurazioni dell’attività nei complessi mitocondriali senza conservazione delle membrane mitocondriali, mancando la valutazione dell’integrità mitocondriale o le misurazioni del contenuto di ATP come parametro per la produzione di ATP mitocondriale. In generale, una corretta valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale e della produzione di ROS richiede l’isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione differenziale in un gradiente percoll/saccarosio. L’isolamento dei mitocondri può anche essere un fattore limitante per il tessuto nervoso sciatico a causa della grande quantità di tessuto necessario e della perdita e interruzione dei mitocondri.

Il presente studio mira a fornire un protocollo per misurare la fisiologia mitocondriale come il consumo di ossigeno mitocondriale e la produzione di ROS nel nervo sciatico, preservando le membrane mitocondriali e senza la necessità di isolare i mitocondri. Questo protocollo è adattato dalle misurazioni del consumo di ossigeno nelle fibre muscolari permeabilizzate24 mediante respirometria ad alta risoluzione (HRR). I vantaggi di questa procedura sono la possibilità di valutare i mitocondri in piccole quantità di tessuto come il nervo sciatico e valutare i parametri mitocondriali in situ, preservando così l’ambiente mitocondriale, la struttura e il profilo bioenergetico, per ottenere un risultato fisiologicamente affidabile. Gli stati respiratori mitocondriali sono stati determinati con substrati e inibitori dopo permeabilizzazione del nervo sciatico per valutare correttamente la bioenergetica mitocondriale e il coefficiente del citocromo c per l’integrità della membrana mitocondriale, fornendo una guida per le fasi della valutazione del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETS) e il calcolo dei parametri essenziali. Questo studio può fornire strumenti per rispondere a domande sui meccanismi fisiopatologici in cui è implicato il metabolismo del nervo sciatico, come le neuropatie periferiche.

Protocol

Il presente protocollo è approvato dal Comitato etico sull’uso degli animali nella ricerca, CCS / UFRJ (CEUA-101/19) e dalle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso di animali da esperimento. Il nervo sciatico è isolato da topi maschi C57BL/6 di quattro mesi, eutanasia per lussazione cervicale secondo le linee guida istituzionali. I passaggi del protocollo sono ottimizzati per evitare il deterioramento mitocondriale. Pertanto, in questo protocollo, la calibrazione dei sensori polarografici di …

Representative Results

Il consumo di ossigeno mitocondriale da parte del nervo sciatico permeabilizzato è rappresentato nella Figura 2. La traccia rossa rappresenta il flusso di O2 per unità di massa in pmol/s.mg. Dopo aver registrato un consumo basale di ossigeno con substrati endogeni (respirazione di routine), il succinato (SUCC) viene iniettato per registrare la respirazione guidata dal complesso II (succinato deidrogenasi), con conseguente aumento del tasso di consumo di ossigeno. In sequenza, vi…

Discussion

Diverse malattie o condizioni che accompagnano le neuropatie hanno la disfunzione mitocondriale come fattore di rischio. La valutazione della funzione mitocondriale nei nervi periferici è essenziale per chiarire come agiscono i mitocondri in queste condizioni neurodegenerative. La valutazione della funzione mitocondriale è laboriosa a causa della difficoltà del metodo di isolamento e della scarsità di materiale. Pertanto, lo sviluppo di tecniche di permeabilizzazione dei tessuti che non richiedono l’isolamento dei mi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è stato finanziato da Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Siamo grati al Dr. Antonio Galina Filho, alla Dr. Monica Montero Lomeli e al Dr. Claudio Masuda per il supporto con le strutture di laboratorio, e alla Dr. Martha Sorenson per i commenti gentili e preziosi nel migliorare l’articolo.

Materials

Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate Sigma-Aldrich A26209
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Amplex Red Reagent Thermo Fisher scientific A12222 Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet
Antimycin A (from Streptomyces sp.) Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7030 heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98%
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C6763
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752 (from equine heart; small hemeprotein)
DataLab version 5.1.1.91 OROBOROS INSTRUMENTS, Austria Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger
Digital orbital microplate shaker 120V Thermo Fisher scientific 88882005
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819
EGTA sodium salt Sigma-Aldrich E8145
Hamilton syringe Sigma-Aldrich HAM80075 10 uL, 25 uL and 50 uL
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution 30% W/W Merck H1009
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich M7397
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2393
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
Micro-dissecting forceps, curved Sigma-Aldrich F4142
Micro-dissecting forceps, straight Sigma-Aldrich F4017
O2K – Filter set Amplex Red OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44321-01 Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17.
O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green OROBOROS INSTRUMENTS, Austria 44210-01
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876 (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C
OROBOROS Oxygraph-2k OROBOROS INSTRUMENTS, Austria http://www.oroboros.at
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) Sigma-Aldrich P4509
Peroxidase from horseradish Sigma-Aldrich P8375
Petri dishes, polystyrene MERCK P5606
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium dihydrogen phosphate monobasic Sigma-Aldrich PHR1330
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 221473
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saponin Sigma-Aldrich SAE0073
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Sodium succinate dibasic hexahydrate Sigma-Aldrich S2378
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
Taurine Sigma-Aldrich T0625

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Cite This Article
Formiga-Jr, M. A., Camacho-Pereira, J. Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry. J. Vis. Exp. (183), e63690, doi:10.3791/63690 (2022).

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