화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

라만 산란 현상은 1928년 C. V. 라만¹에 의해 처음 관찰되었다. 입사 광자가 샘플과 상호 작용할 때, 비탄성 산란 사건이 자발적으로 발생할 수 있으며, 여기서 광자의 에너지 변화는 분석 된 화학 종의 진동 전이와 일치합니다. 이 공정은 화학 태그를 사용할 필요가 없으므로 시료 교란을 최소화하면서 화학 분석을위한 다용도의 라벨이없는 도구입니다. 장점에도 불구하고, 자발적인 라만 산란은 낮은 산란 단면 (일반적으로 적외선 [IR] 흡수 단면보다^10,11 낮음)을 앓고 있으며, 이는 분석²를 위해 긴 획득 시간을 필요로합니다. 따라서, 라만 산란 공정의 감도를 증가시키기 위한 탐구는 실시간 이미징을 위한 라만 기술을 추진하는데 필수적이다.

라만 산란의 감도를 크게 향상시키는 한 가지 효과적인 방법은 일관된 라만 산란 (CRS) 프로세스를 사용하는 것이며, 일반적으로 두 개의 레이저 펄스가 분자 진동 전이 ^3,4를 자극하는 데 사용됩니다. 두 레이저 사이의 광자 에너지 차이가 샘플 분자의 진동 모드와 일치하면 강한 라만 신호가 생성됩니다. 이미징을 위해 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 CRS 프로세스는 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS)과 자극 라만 산란 (SRS)⁵입니다. 지난 이십 년 동안 기술 개발은 CARS 및 SRS 현미경 검사 기술을 발전시켜 생물학적 샘플의 화학적 변화에 대한 라벨 없는 정량화 및 해명을위한 강력한 도구가되었습니다.

CARS 현미경에 의한 화학 이미징은 Duncan et al⁶에 의해 입증 된 CARS 이미지를 얻기 위해 레이저 스캐닝이 처음 적용되었을 때 1982 년으로 거슬러 올라갈 수 있습니다. CARS 현미경의 현대화는 레이저 스캐닝 다중 광자 형광 현미경⁷의 광범위한 적용 후에 크게 가속화되었습니다. 높은 반복률 레이저를 사용하는 Xie 그룹의 초기 연구는 CARS를 생물학적 샘플 8,9,10에서 분자의 특성화를위한 고속, 라벨이없는 화학 이미징 플랫폼으로 전환했습니다. CARS 이미징의 주요 문제 중 하나는 비공진 배경의 존재로 이미지 대비가 감소하고 라만 스펙트럼이 왜곡된다는 것입니다. 비공진 배경 11,12,13,14,15를 감소시키거나 CARS 스펙트럼^(16,17)으로부터 공진 라만 신호를 추출하기 위해 많은 노력이 이루어졌다. 이 분야를 크게 발전시킨 또 다른 발전은 하이퍼 스펙트럼 CARS 이미징으로, 화학적 선택성^18,19,20,21이 향상된 각 이미지 픽셀에서 스펙트럼 매핑을 ^{허용합니다.}

자극 라만 산란 (SRS)은 CARS보다 젊은 이미징 기술이지만²² 년 초에 발견되었습니다. 2007년에, SRS 현미경은 낮은 반복률 레이저 소스(²³)를 사용하여 보고되었다. 곧, 몇몇 그룹은 높은 반복률 레이저^24,25,26을 사용하여 고속 SRS 이미징을 시연^했습니다. CARS에 대한 SRS 현미경 검사의 주요 장점 중 하나는 비공진 배경(²⁷)의 부재이지만, 교차 위상 변조(XPM), 과도 흡수(TA), 이광자 흡수(TPA) 및 광열(PT) 효과와 같은 다른 배경은 SRS(²⁸)에서 발생할 수 있다. 또한, SRS 신호 및 샘플 농도는 CARS와 달리 선형 관계를 가지며, 이는 직교 신호-농도 의존성⁽²⁹)을 갖는다. 이것은 화학적 정량화와 스펙트럼 언믹싱을 단순화합니다. 다색 및 하이퍼스펙트럼 SRS는 30,31,32,33,34,35,36 형태로 진화해 왔으며, 스펙트럼 초점은 화학 이미징 ^37,38에 대한 가장 보편적인 접근법 중 하나이다.

CARS와 SRS 모두 신호 여기를 위한 분자의 진동 전이와 일치하도록 펌프와 스토크스 레이저 빔을 샘플에 집중해야 합니다. CARS 및 SRS 현미경도 공통점이 많습니다. 그러나 이러한 두 프로세스의 근간이 되는 물리학과 이러한 현미경 기술에 관련된 신호 검출은^3,39의 불균형을 가지고 있습니다. CARS는 순 광자-분자 에너지 커플링³을 갖지 않는 파라메트릭 공정이다. 그러나, SRS는 비모수 프로세스이며, 광자와 분자 시스템⁽²⁷) 사이의 에너지 전달에 기여한다. CARS에서는 스토크스 방지 주파수에서 새로운 신호가 생성되고, SRS는 펌프와 스토크스 레이저 빔 사이의 에너지 전달로 나타납니다.

CARS 신호는 Eq (1)²⁸을 만족한다.

(1)

한편, SRS 신호는 Eq(2)28로서 기입될 수 있다.

(2)

여기서, I _p, Is, I CARS 및 ΔI SRS는 각각 펌프 빔, 스토크스 빔, _{CARS 신호 및 SRS} 신호의 강도이다. χ⁽³⁾은 샘플의 3차 비선형 광학 감수성이며, 실제 및 허수 부분으로 구성된 복합 값입니다.

이들 방정식은 CARS 및 SRS의 스펙트럼 프로파일과 신호-농도 의존성을 표현한다. 물리학의 차이는이 두 현미경 기술에 대한 이질적인 검출 체계를 초래합니다. CARS에서의 신호 검출은 일반적으로 새로 생성된 광자의 스펙트럼 분리 및 광승수 튜브(PMT) 또는 전하 결합 장치(CCD)를 사용한 검출을 포함한다. SRS의 경우, 펌프와 스토크스 빔 사이의 에너지 교환은 일반적으로 광 변조기를 사용하는 고속 강도 변조 및 록인 증폭기와 페어링된 광 다이오드(PD)를 사용한 복조로 측정됩니다.

최근 몇 년 동안 CARS 및 SRS 분야에서 많은 기술 개발 및 응용 프로그램이 발표되었지만 두 CRS 기술에 대한 체계적인 비교는 동일한 플랫폼, 특히 하이퍼 스펙트럼 CARS 및 SRS 현미경에 대해 수행되지 않았습니다. 감도, 공간 분해능, 스펙트럼 분해능 및 화학적 분리 능력을 직접 비교하면 생물학자가 화학 정량화에 가장 적합한 형식을 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 펨토초 레이저 시스템 및 스펙트럼 포커싱을 기반으로 하이퍼스펙트럼 CARS 및 SRS 형식을 모두 갖춘 멀티모달 이미징 플랫폼을 구축하기 위한 상세한 단계가 제공됩니다. 두 기술은 스펙트럼 해상도, 검출 감도, 공간 해상도 및 세포의 이미징 대비를 위해 전진 방향으로 비교되었습니다.