Kwantificeren van de bindingsinteracties tussen Cu (II) en peptideresiduen in de aan- en afwezigheid van chromoforen

De biologie is geëvolueerd om gebruik te maken van de diverse chemie van metaalionen die nodig zijn voor het leven om zich aan te passen en te overleven in de omgeving. Naar schatting 25%-50% van de eiwitten gebruikt metaalionen voor structuur en functie¹. De specifieke rol en redoxtoestand van het metaalion is direct gerelateerd aan de samenstelling en geometrie van de biologische liganden die het coördineren. Bovendien moeten redox-actieve metaalionen zoals Cu (II) strak worden gereguleerd, zodat ze niet interageren met oxidatiemiddelen via Fenton-achtige chemie om reactieve zuurstofsoorten (ROS) te vormen ^2,3,4. Het begrijpen van de bindingsmodi en affiniteit die de biochemie aansturen, zou moeten helpen de biologische rol van het metaalion op te helderen.

Veel technieken worden gebruikt om de bindingsinteracties van metalen en peptiden te bestuderen. Dit zijn meestal spectroscopische technieken, maar omvatten ook computersimulaties met behulp van moleculaire dynamica, zoals gezien door Cu(II) interacties met een fragment van amyloïde bèta (Aβ)⁵. Een veelgebruikte spectroscopische techniek die voor veel universiteiten toegankelijk is, is kernspinresonantie (NMR). Door gebruik te maken van de paramagnetische aard van Cu(II) konden Gaggelli et al. aantonen waar het metaalion zich bindt aan een petide door ontspanning van nabijgelegen kernen⁶. Elektron paramagnetische resonantie (EPR) kan ook worden gebruikt om de locatie en modus van de paramagnetische metaalionbinding^{te onderzoeken 7}. Andere spectroscopische technieken zoals circulair dichroïsme (CD) kunnen de coördinatie over Cu(II) in systemen zoals tripeptidesystemen⁸ beschrijven, en massaspectrometrie kan stoichiometrie aantonen en op welke residuen het metaalion wordt gecoördineerd door fragmentatiepatronen ^9,10.

Sommige van deze technieken, zoals NMR, zijn labelvrij, maar vereisen grote concentraties peptide, wat uitdagingen vormt voor studie. Een andere veel voorkomende techniek genaamd fluorescentiespectroscopie is gebruikt om de positie van een tyrosine of tryptofaan te relateren aan het blussen van een Cu (II) ^11,12. Evenzo kan deze techniek structurele veranderingen vertonen als gevolg van Cu(II)-binding¹³. Uitdagingen met deze metaal-peptidebindingsstudies zijn echter dat ze chromofoor aminozuren zoals tyrosine onderzoeken die niet alle systemen hebben, dat het metaalion bindt onder een klassiek model en dat de techniek mogelijk niet bevorderlijk is onder fysiologische omstandigheden. Er zijn inderdaad verschillende peptiden in opkomst die dergelijke chromofoor aminozuren niet bevatten of binden onder klassieke modellen, waardoor het gebruik van deze technieken wordt uitgesloten^14,15. Dit artikel beschrijft benaderingen voor het beoordelen van bindende eigenschappen in deze scenario’s onder fysiologisch relevante omstandigheden.

Biologische liganden kunnen verschillende protonatietoestanden aannemen die de metaalionbinding kunnen beïnvloeden, zoals de imidazoolring op histidine. Als de pH niet consistent wordt gehandhaafd, kunnen de resultaten ingewikkeld of tegenstrijdig zijn. Om deze reden zijn buffers een essentieel onderdeel in de studie van metaal-eiwit/peptide interacties. Van veel buffers is echter aangetoond dat ze gunstig interageren met metaalionen^16,17. Naast het concurreren met het biologische molecuul van belang, kan de buffer vergelijkbare coördinerende atomen hebben die moeilijk te onderscheiden zijn van de coördinerende atomen van het peptide of eiwit. In deze studie ligt de focus op elektronische absorptiespectroscopie en isothermische titratiecalorimetrie (ITC) als twee complementaire technieken voor het bestuderen van Cu(II)-peptide-interacties, met speciale overwegingen met betrekking tot bufferkeuze.

Elektronische absorptiespectroscopie is een snelle, breed toegankelijke techniek voor het bestuderen van metaalbindingsinteracties. Bestraling met licht in de ultraviolette (UV) of zichtbare golflengten kan leiden tot absorptie van metaalgecentreerde d-d-banden, die waardevolle informatie opleveren over ligandclassificatie, metaalgeometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten^18,19. Voor deze complexen kunnen directe titraties van metaalionen in eiwit- of peptideoplossingen bindende stoichiometrieën en schijnbare bindingsaffiniteiten kwantificeren. In sommige gevallen, zoals d⁵ of d¹⁰ elektronenconfiguraties, absorbeert het complex geen licht (d.w.z. is spectroscopisch stil). In deze spectroscopisch stille overgangsmetaalcomplexen kunnen deze beperkingen worden omzeild door een concurrerend ligand te gebruiken dat, bij coördinatie met het metaalion, detecteerbare ladingsoverdrachtsbanden oplevert. In beide gevallen is deze benadering beperkt tot het kwantificeren van alleen stoichiometrie en schijnbare bindingsaffiniteit, en wordt er geen inzicht in bindingsenthalpie gegeven zonder benaderingen.

Als aanvulling op informatie verkregen uit elektronische absorptiespectroscopie, is ITC een aantrekkelijke techniek voor directe en rigoureuze kwantificering van de bindende enthalpie²⁰. ITC meet direct de warmte die vrijkomt of wordt verbruikt tijdens een bindingsgebeurtenis en aangezien de titratie plaatsvindt bij constante druk, is de gemeten warmte de enthalpie van alle evenwichten (ΔH_ITC). Daarnaast worden de stoichiometrie van de bindingsgebeurtenis (n) en de schijnbare bindingsaffiniteit (K_ITC) gekwantificeerd. Uit deze parameters worden de vrije energie (ΔG_ITC) en entropie (ΔS_ITC) bepaald, waardoor een thermodynamische momentopname van de bindingsgebeurtenis ontstaat. Omdat het niet afhankelijk is van lichtabsorptie, is ITC een ideale techniek voor spectroscopisch stille soorten, bijvoorbeeld d⁵ of d¹⁰ metaalionencomplexen. Aangezien calorimetrie echter warmte meet, kunnen niet-overeenkomende buffersystemen en niet-geregistreerde evenwichten de analyse nadelig beïnvloeden om de metaalionenbindende thermodynamica nauwkeurig te bepalen, en er moet grote zorg worden besteed aan het aanpakken van deze factoren²⁰. Indien uitgevoerd met de juiste striktheid, is ITC een robuuste techniek voor het bepalen van de thermodynamica van metaal-eiwit / peptidecomplexen.

Hier wordt een chromoforisch stil koperbindend peptide, C-peptide, gebruikt om het complementaire gebruik van de twee technieken te demonstreren. C-peptide is een 31 residu splitsingsproduct (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) gevormd tijdens insulinerijping; het mist chromofore residuen, maar het is aangetoond dat het Cu(II) bindt met fysiologisch relevante affiniteit ^14,15. De Cu(II)-bindingsplaats bestaat uit de zijketens van een glutamaat en een aspartaat en de N-terminus van het peptide^14,15. Deze coördinerende atomen lijken sterk op die van veel gebruikte gebufferde systemen. Hier wordt het tandemgebruik van de d-d- en ladingsoverdrachtsbanden in elektronische absorptiespectroscopie en ITC getoond bij het kwantificeren van de Cu (II) bindende thermodynamica aan C-peptide. De benadering van het bestuderen van Cu (II) binding aan C-peptide kan worden toegepast op andere metaalionen en eiwit / peptide systemen.