Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Vojtech Gabriel; Christopher Zdyrski; Dipak K. Sahoo; Kimberly Dao; Agnes Bourgois-Mochel; Todd Atherly; Marilyn N. Martinez; Donna A. Volpe; Jamie Kopper; Karin Allenspach; Jonathan P. Mochel

doi:10.3791/63612

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

면역학 및 감염병학

Кишечные органоиды собак в двухкамерной проницаемой вспомогательной системе

Published: March 02, 2022

doi:

10.3791/63612

Vojtech Gabriel¹, Christopher Zdyrski¹, Dipak K. Sahoo², Kimberly Dao³, Agnes Bourgois-Mochel², Todd Atherly³, Marilyn N. Martinez⁴, Donna A. Volpe⁵, Jamie Kopper², Karin Allenspach^2,3, Jonathan P. Mochel^1,3

¹Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, ²Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine,Iowa State University, ³3D Health Solutions Inc., ⁴Office of New Animal Drug Evaluation,Center for Veterinary Medicine, Food and Drug Administration, ⁵Division of Applied Regulatory Science, Office of Clinical Pharmacology, Office of Translational Sciences,Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administration

Summary

Здесь мы представляем протокол, описывающий культуру кишечных органоидов собак в двухкамерной, проницаемой опорной системе. Описано посев органоидов в проницаемых опорах, поддержание монослоя и последующие эксперименты с лекарственной проницаемостью.

Abstract

Проницаемая опорная система обычно используется в сочетании с традиционными двумерными (2D) клеточными линиями в качестве инструмента in vitro для оценки пероральной проницаемости новых терапевтических препаратов-кандидатов. Однако использование этих обычных клеточных линий имеет ограничения, такие как измененная экспрессия плотных соединений, частичная дифференцировка клеток и отсутствие ключевых ядерных рецепторов. Несмотря на эти недостатки, модели Caco-2 и MDCK широко приняты и подтверждены для прогнозирования пероральной проницаемости человека in vivo .

Собаки являются актуальной трансляционной моделью для биомедицинских исследований из-за их сходства в анатомии желудочно-кишечного тракта и микрофлоры кишечника с человеком. Соответственно, и в поддержку параллельной разработки лекарств, разработка эффективного и точного инструмента in vitro для прогнозирования характеристик проницаемости препарата in vivo как у собак, так и у людей очень желательна. Таким инструментом может быть собачья кишечная органоидная система, характеризующаяся трехмерными (3D), самосборными эпителиальными структурами, полученными из взрослых стволовых клеток.

(1) Протокол проницаемого вспомогательного посева описывает экспериментальные методы диссоциации и посева органоидов собак во вставках. Выделение органоидов собак, культивирование и извлечение урожая были ранее описаны в отдельном наборе протоколов в этом специальном выпуске. Методы общего содержания органоидного монослоя кишечного кишечника собак подробно обсуждаются в (2) Протоколе поддержания монослоя. Кроме того, этот протокол описывает методы оценки структурной целостности монослоя с помощью измерений трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и световой микроскопии. Наконец, (3) Экспериментальный протокол проницаемости описывает задачи, непосредственно предшествующие эксперименту, включая проверку экспериментальных результатов in vitro .

В целом, собачья органоидная модель в сочетании с технологией двухкамерной клеточной культуры преодолевает ограничения, связанные с 2D-экспериментальными моделями, тем самым повышая надежность прогнозов кажущейся пероральной проницаемости терапевтических препаратов-кандидатов как у собаки, так и у человека.

Introduction

Проницаемые опорные системы обычно используются для определения кажущейся проницаемости терапевтических препаратов-кандидатов через кишечный эпителиальный барьер ^1,2. Они также могут быть использованы для оценки клеточной секреции³, миграции клеток⁴ и токсичности лекарств⁵. Анализ пероральной проницаемости препарата in vitro является ключевым шагом в процессе открытия и разработки лекарств², при этом отдельные кандидаты на лекарства тестируются на ранней стадии жизненного цикла исследований и разработок препарата⁶. Проницаемая опорная система представляет собой двухкамерный клеточный культуральный аппарат, состоящий из вставки с полупористой мембраной, помещенной в многоязычную пластину. Эта система обеспечивает прямой доступ к апикальной и базолатеральной сторонам ячеистого монослоя, выращенного во вставке⁷. Монослой, используемый в этих системах, обычно получают из эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта (например, клеточная линия колоректальной аденокарциномы человека Caco-2)⁸. Клеточные культуры растут в поляризованном состоянии, имитируя естественную микроархитектуру эпителиальных клеток кишечника, обеспечивая дальнейшую клеточную дифференцировку, аналогичную микроанатомию и функцию⁷. Подробную информацию о проницаемой опорной вставке можно найти на рисунке 1. Посев вставок 2D клеточными культурами, традиционно используемыми для оценки проницаемости кишечного препарата, относительно доступен и прост в культивировании⁹. Эти системы имеют несколько основных ограничений, включая их ограниченную способность прогнозировать кишечный метаболизм терапевтических препаратов-кандидатов^10,11. Это верно для всех механизмов абсорбции лекарственного средства, будь то пассивная абсорбция через плотные соединения между эпителиальными клетками, активная трансэпителиальная абсорбция через эффлюкс или транспортеры поглощения (например, Р-гликопротеин, транспортер монокарбоксилата 1) и препараты, которые метаболизируются энтероцитами.

Собаки разделяют общую среду обитания и диету с людьми¹². Анатомия кишечника собак и состав микробиома очень напоминают анатомию людей¹³, что было связано с одомашниванием и общими диетами за последние 36 000 лет¹⁴. К сожалению, эти сходства также могут быть общими причинами / триггерами развития заболевания. У собак развиваются хронические заболевания, аналогичные человеческим, таким как ожирение¹⁵, воспалительное заболевание кишечника¹⁶, колоректальная аденокарцинома¹⁷, стромальная опухоль желудочно-кишечного тракта (GIST)¹⁸ и различные другие патологии, связанные с их относительной продолжительностью жизни¹⁹. Соответственно, собачьи органоиды могут быть успешно использованы для обратных трансляционных исследований этих хронических многофакторных заболеваний в духе Инициативы единого здоровья²⁰.

Клетки Caco-2 являются наиболее используемыми клеточными линиями для пероральных абсорбционных анализов^{лекарственного средства 21}. Эти клетки в настоящее время считаются моделью «золотого стандарта» для анализов проницаемости кишечника in vitro ^2,22,23. Клеточная линия Caco-2 экспрессирует транспортеры эффлюкса и поглощения, обнаруженные в кишечном тракте человека, хотя и на разных уровнях экспрессии 24,25,26. Клетки Caco-2 также широко используются в качестве моделей для определения того, является ли препарат субстратом или ингибитором транспортеров кишечного эффлюкса^22,27. Хотя клетки Caco-2 имеют толстоберное происхождение, они имитируют клетку энтероцитов. К сожалению, клетки Caco-2 представляют собой только один тип клеток из эпителиального слоя тонкой кишки⁹, который не может точно повторить сложный состав эпителиальных клеток кишечника. Например, бокаловидные клетки, предназначенные для производства слизи, отсутствуют в культурах Како-2, так что взаимодействия слизи и лекарств не могут быть оценены без кокультуры с другими клеточными линиями²⁸. Кроме того, культуры Caco-2 не экспрессируют несколько важных ядерных рецепторов, обычно присутствующих в кишечнике, таких как рецептор прегнана X (PXR), рецептор стероида X (SXR) и конститутивный рецептор андростана (CAR)²⁹. Следовательно, культуры Caco-2 не могут моделировать индукцию переносчиков лекарств и ферментов некоторыми лекарственными средствами, которые являются индукторами этих рецепторов (например, рифампин)³⁰.

Технология 3D-органоидов кишечника устраняет некоторые из этих ограничений¹⁹. Органоиды представляют собой самосборные конструкции, полученные из взрослых стволовых клеток, которые могут быть установлены из образцов тканей, собранных с использованием микроинвазивных методов²⁰. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки используются для моделей кишечной проницаемости^31,32. Собачьи органоиды обеспечивают соответствующую альтернативу человеческим органоидам, поскольку исследования стволовых клеток человека ограничены этическими вопросами³³. Кроме того, органоиды собак обеспечивают систему in vitro для изучения проницаемости собачьих лекарств, метаболизма, активного транспорта и лекарственного взаимодействия. Чтобы устранить этот технологический пробел, последовательный и надежный рост органоидов кишечника собак в проницаемой системе поддержки был описан³⁴. Анализ проницаемости с органоидами кишечника собак может потенциально предсказать проницаемость кишечника собак и метаболизм малых молекул лекарств по сравнению с используемыми в настоящее время анализами (Caco-2). Подтверждение этих ключевых особенностей дает эту новую систему in vitro для будущей работы, исследующей потенциальное влияние индукторов на внутриклеточный метаболизм и активный транспорт.

Собачьи органоиды состоят из всех типов клеток, обычно присутствующих в эпителиальном слое кишечника. С функциональной и микроанатомической точки зрения они надежно воспроизводят среду эпителиального слоя кишки собаки^19,35. Кроме того, наличие слизи, специфических для собак переносчиков лекарств и ферментов, а также общая клеточная дифференциация в органоидах кишечника собак сопоставимы с тем, что наблюдается in vivo у собак³⁴. Таким образом, органоиды могут быть выделены из больных ветеринарных пациентов и использованы для моделирования влияния различных болезненных процессов (например, хронического воспаления кишечника) на проницаемость перорального препарата собак^19,36. Органоидная система кишечника собак также может быть использована в других условиях, кроме экспериментов с лекарственной проницаемостью. Эти 3D-структуры также могут быть выделены у больных пациентов, как ранее описано Chandra et al. для воспалительного заболевания кишечника, колоректальной аденокарциномы и стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта¹⁹.

Протокол проницаемого поддерживающего посева описывает методы создания органоидных культур кишечника собак во вставках. Этот первый протокол описывает методы диссоциации установленных собачьих органоидных культур, покрытых внеклеточным мембранным матриксом. Кроме того, в этом протоколе обсуждается предварительное покрытие вставок коллагеном I и матрицей внеклеточной мембраны. Также подробно описано встраивание органоидов собак в проницаемые опорные вставки.

Вторым протоколом является протокол обслуживания монослоя, который включает в себя общее содержание собачьих 3D-органоидов, покрытых во вставке. Частота и объемы органоидных сред, используемых для обновления культуры, и способы предотвращения повреждения клеточной культуры представлены в этом втором протоколе вместе с экспериментальными методами оценки слияния эпителиального монослоя.

Наконец, Экспериментальный протокол проницаемости фокусируется на способах определения того, готовы ли 3D-органоиды кишечника собак в анализе проницаемости к экспериментальному использованию и этапам проверки, необходимым перед проведением любого эксперимента. В этом разделе также описывается установка и успешное выполнение эксперимента по проницаемости, а также инкубация и отбор проб терапевтических лекарств-кандидатов в камерах однослойной культуры. Также обсуждается использование низкопроницаемого изотиоцианата флуоресцеина (FITC-декстран) для контроля целостности монослоя. Наконец, описан метод оценки in vitro для подтверждения результатов после завершения эксперимента. Эксперименты с проницаемостью являются чрезвычайно обширной темой и очень хорошо обобщены Hubatsch et ^al.37. Рабочий процесс протоколов обобщен на рисунке 2.

Рисунок 1: Кишечные органоиды собак на проницаемой опорной системе. Проницаемая опорная вставка расположена в колодце из 24-луночной плиты. Микропористая мембрана позволяет высеивать диссоциированные органоиды кишечника собак, и эти клетки в конечном итоге образуют органоидный 2D-монослой. Эта технология обеспечивает доступ как к AP, так и к BL сторон монослоя. Органоидная среда вводится как в камеру AP, так и в камеру BL проницаемой опоры. Проиллюстрированы абсорбция (AP→BL) и секреция (BL→AP) препарата-кандидата, а также два возможных способа транспортировки лекарственного средства. Сокращения: AP = апикальный; BL = базолатеральный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Рабочий процесс проницаемых протоколов поддержки органоидов собак. Проницаемую опорную вставку предварительно покрывают смесью внеклеточного мембранного матрикса и коллагена I и инкубируют в течение 1 ч. В процессе инкубации органоидная культура диссоциируется. Отдельные органоидные клетки засевают во вставку, среда в базолатеральной камере добавляется сразу после посева, в то время как среда в апикальную камеру добавляется через 24 ч после завершения процесса посева. Поддержание и мониторинг органоидов включает регулярные изменения среды, измерения значения TEER и световую микроскопию для оценки целостности монослоя. Перед экспериментом органоиды должны быть дифференцированы путем удаления ингибитора ROCK и GSKiβ из среды. Значения TEER измеряются в день эксперимента, а органоидный монослой проверяется с помощью световой микроскопии на предмет повреждения клеток. Затем среду обменивают на соответствующий буфер и инкубируют перед экспериментом. Анализ FITC-декстрана используется во время экспериментов по кишечной проницаемости³⁹ в качестве маркера целостности монослоя. Измерения TEER проводятся после эксперимента, а световая микроскопия подтвердит результаты через 24 часа. Сокращения: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление; ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; F = флуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

Исследование было одобрено и выполнено в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Айова (IACUC-19-337; МАКУК-18-065; МАКУК-19-017). В следующем разделе (этапы 1.1-1.3) описывается протокол проницаемого вспомогательного посева, а процедуры кратко изложены на рисунке 3. Рисунок 3: Рабочий процесс проницаемого протокола заполнения поддержки. Проницаемые опорные вставки предварительно покрываются комбинацией CMGF+ R/G, коллагена I и внеклеточного мембранного матрикса и впоследствии инкубируются. Среду из собачьей органоидной культуры аспирируют и заменяют раствором для восстановления клеток с последующей 30-минутной инкубацией при 4 °C. Культуру впоследствии переносят в трубку, а органоидную диссоциацию проводят с использованием трипсин-подобной протеазы. Недиссоциированные органоиды удаляются путем прохождения через ситечко для достижения одноклеточной суспензии, а концентрацию клеток определяют с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Клетки засевают на проницаемую опорную вставку, а CMGF+ R/G добавляют в базолатеральную камеру. Затем культуру инкубируют в течение 24 ч, а оставшуюся жидкость удаляют из апикальной камеры и заменяют CMGF+ R/G. Сокращения: ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 1. Проницаемая поддержка протокола заполнения Предварительное покрытие проницаемых опорных вставок Готовят полную среду с факторами роста, усиленными ингибитором Rho-ассоциированной протеинкиназы (ROCK) и ингибитором гликогенсинтазы-киназы-бета (GSKiβ) (CMGF + R/G) согласно информации в таблице 1. Подготовьте ведро со льдом и начните таяние внеклеточного мембранного матрикса на льду. Поместите в инкубатор 24-луночную пластину, содержащую необходимое количество вставок, чтобы прогреть. Соберите коллаген I крысиного хвоста (3 мг/мл) и поместите его на лед, защищая от света. Соберите CMGF + R/G и поместите его на лед. Рассчитайте общее количество вкладышей и заготовок, необходимых для эксперимента, оставив в стороне 100 мкл раствора покрытия для каждой вставки.ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте больше раствора для покрытия, чем необходимо; рекомендуется готовить не менее чем на 15% больше, чем необходимо. В пробирке объемом 15 мл смешайте CMGF+ R/G с внеклеточным мембранным матриксом (1%) и коллагеном I (1%) и аккуратно пипетируйте смесь. Покройте каждую полиэфирную вставку 100 мкл раствора покрытия и поместите вставки в инкубатор (37 °C; 5% CO2 атмосферы) в течение 1 ч. После инкубации осторожно аспирируйте раствор покрытия с каждой вставки с помощью вакуумного аспиратора или пипетки P1000, стараясь не потревожить фильтр вставки. Поместите предварительно покрытую пластину в инкубатор, чтобы согреться. Диссоциация органоидов собакПРИМЕЧАНИЕ: Используйте собачьи органоиды, которые культивировались в течение не менее четырех дней. Прежде чем начать диссоциацию, обратитесь к Gabriel et al.38 , чтобы определить, когда образец является здоровым, плотным и достаточным для экспериментов. Рекомендуется диссоциировать одну дополнительную лунку органоидов для каждой процедуры покрытия скважины. Кроме того, рекомендуется увеличить желаемое количество вставок на ~ 20%, чтобы учесть неравномерный рост органоидов или повреждение, вызванное неправильными манипуляциями. Если планируется использовать FITC-декстран, подготовьте дополнительные скважины. Подготовьте ведро со льдом и флакон с холодным 1x Advanced DMEM/F12 в шкафу биобезопасности. Поместите внеклеточный мембранный матрикс на лед, чтобы начать таяние, погружая его в лед, чтобы защитить от быстрого оттаивания и избежать затвердевания. Поместите коробку с наконечниками пипетки (P200) в морозильную камеру для покрытия внеклеточного мембранного матрикса. Предварительно охладить охлажденную центрифугу до 4 °C. Переместите CMGF+ R/G из морозильной камеры/холодильника на водяную баню с температурой 37 °C. Избегайте прямого воздействия света, когда это возможно. Удалите всю среду из 24-луночной пластины с органоидной культурой для соответствующего количества лунок (1 лунка из 24-луночной пластины на 2-4 вставки), заботясь о том, чтобы не нарушить матрицу внеклеточной мембраны.ПРИМЕЧАНИЕ: Объем может варьироваться в зависимости от используемой системы подсчета ячеек. Добавьте 0,5 мл предварительно охлажденного раствора для восстановления клеток на лунку для растворения куполов внеклеточного мембранного матрикса. Инкубировать пластину в холодильнике (4 °C) в течение 30 мин. Пипетку суспензии, собирают все органоиды и растворенный внеклеточный мембранный матрикс, и переносят их в трубку объемом 15 мл. Центрифугу (700 × г в течение 5 мин при 4 °C) и удаляют супернатант до тех пор, пока уровень не достигнет отметки 0,5 мл, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу. Добавьте 1 мл трипсин-подобной протеазы и инкубируйте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 8 мин. Проведите трубкой несколько раз в течение инкубационного периода, чтобы перемешать клетки. Перенесите пробирку с образцом обратно в шкаф биобезопасности и медленно добавьте 7 мл предварительно охлажденного Advanced DMEM/F12, чтобы инактивировать трипсин-подобную протеазу и остановить диссоциацию клеток. Предварительно установите 40-мкм клеточный сетчатый фильтр с 1 мл Advanced DMEM/F12. Аккуратно пипетируйте смесь и фильтруйте суспензию насквозь; пипетка дополнительная Advanced DMEM/F12 для промывки ситечка. Центрифугируют пробирку (700 × г в течение 5 мин при 4 °C) и удаляют супернатант. Не мешайте гранулам. Повторно суспендировали клеточную гранулу в ~50-100 мкл питательной среды (CMGF+ R/G) для каждой лунки органоидов, которая была диссоциирована. Подсчитайте подвыборку суспензии (~10 мкл) с помощью гемоцитометра или соответствующей машины и определите общее количество клеток в суспензии. Посев органоидов собак Разбавьте или сконцентрируйте клеточную суспензию для получения клеточной концентрации ~75 000 клеток на мл. Помейте 100 мкл суспензии в каждую вставку, используя BSA (1%) предварительно покрытые кончики, чтобы избежать адгезии клеток во время переноса. Добавьте одну пластину с покрытием в виде бесклеточной заготовки без каких-либо органоидов, растущих при этом, все еще получая регулярные изменения среды. Осторожно закрутите пластину круговыми движениями в течение ~ 30 с, чтобы рассеять семенные клетки по всей вставке. Подтвердите с помощью световой микроскопии равномерное распределение клеток. Добавьте 700 мкл CMGF + R/G в базолатеральную камеру и поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% CO2 атмосферы) на 24 ч. Через 24 ч осторожно извлеките клеточную суспензию из апикальной камеры и замените ее 200 мкл CMGF + R/G. Верните пластину в инкубатор. 2. Протокол поддержания монослоя органоидных клеток ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе (этапы 2.1-2.2) описывается протокол поддержания монослоя органоидных клеток. Рабочий процесс процедур, представленных в этом протоколе, обобщен на рисунке 4. Таблица для принятия заметок, которая может помочь в стандартизации измерений значений TEER, представлена в дополнительной таблице 1. Рисунок 4: Рабочий процесс обслуживания проницаемой культуры поддержки. Значения TEER измеряются с помощью электродов (зондов) и вольт/Омметра. Зонды должны быть химически стерилизованы 70% спиртом перед введением в скважины. Измеряются вставки пустых и органоидных клеток и вычисляются значения TEER. Среда впоследствии обновляется как в апикальной, так и в базолатеральной камерах, а собачья органоидная культура на вкладыше визуализируется с помощью световой микроскопии. Разрывы в органоидной культуре или микропористой мембране отмечаются и обрабатываются в соответствии с протоколом. Аббревиатура: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Измерение значения TEERПРИМЕЧАНИЕ: Измерение значения TEER выполняется с помощью измерителя эпителия вольт/Ом с насадкой для еды. Ознакомьтесь с инструкцией производителя по применению. Значения TEER предоставляют информацию о целостности монослоя собачьих органоидов. Проводите измерения значения TEER каждый альтернативный день во время роста клеточной культуры. Переместите эпителиальный вольт/Омметр и его электроды в шкаф биобезопасности. Перед использованием химически стерилизуйте электроды в 70% спирте. Установите для функции значение Ом. Подождите не менее одной минуты, пока электроды не высохнут. Перед первым измерением вставьте проволочный электрод в порт и включите питание. Убедитесь, что счетчик отображает 1000 Ω с проволочной электродной вставкой вместо измерительных палочек для еды. Если это не так, отрегулируйте устройство. Вставьте электроды в апикальную и базолатеральную камеру бесклеточной вставки (заготовки), чтобы апикальная камера содержала более короткий электрод, а базолатеральная камера содержала более длинный электрод (как показано на рисунке 4). Не прикасайтесь к мембране, но в то же время следите за тем, чтобы электроды были погружены в среду. Подождите несколько секунд, пока значение не стабилизируется, и запишите его в лабораторной книге. Измерьте оставшиеся органоидные монослои собак, обязательно стерилизуя электроды 70% спиртом при измерении различных образцов. Следите за тем, чтобы не коснуться монослоя органоида электродом. После того, как измерения сделаны, стерилизуйте электроды 70% спиртом в последний раз. Обязательно защитите их от повреждений, вызванных неправильными манипуляциями, и храните их в соответствии с инструкциями производителя. Рассчитайте значения TEER для каждой скважины, используя Eq (1), гдеобразец R изаготовка R – это значения Ом (Ω) из монослойной и пустой скважин соответственно, а площадь (см²) – это площадь вставки. (1) Обслуживание монослояПРИМЕЧАНИЕ: Просмотрите рекомендуемый план средних изменений в таблице 2. Используя стерильные одноразовые 9-дюймовые пипетки Пастера и вакуумный аспиратор, аккуратно аспирируйте среду из апикальной, а затем базолатеральной камер. Наклоните пластину, чтобы четко увидеть среднюю поверхность. Избегайте аспирации слишком близко к микропористой мембране в апикальной камере, чтобы предотвратить повреждение монослоя клетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новую пипетку Пастера при перемещении между образцами. Пипетки также являются возможной заменой этой процедуры. Медленно добавляйте CMGF+ R/G с помощью пипеток P1000, нацеленных на стенку апикальной или базолатеральной камеры. Выполняйте изменение среды в апикальной камере очень осторожно, чтобы не повредить монослой. Проверяйте лунки через день под световым микроскопом, оценивая здоровье культуры и контролируя разрывы в органоидном монослое или микропористой мембране. Используйте фазово-контрастную микроскопию, чтобы выделить детали культуры.ПРИМЕЧАНИЕ: В случае собачьих органоидных монослойных разрывов монослою дается время для восстановления и роста. В случае разрывов микропористой мембраны скважину необходимо исключить из эксперимента. Таблица 2: Рекомендации по изменению среды для органоидных культур. CMGF+ R/G изменяется в апикальной и базолатеральной камере скважин через день в каждый альтернативный день. Более длительный культурный период в выходные дни требует увеличения объема среды как в базолатеральной, так и в апикальной камерах, который применяется в пятницу днем и изменяется в понедельник. Сокращения: ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. 3. Экспериментальный протокол проницаемости ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе (этапы 3.1-3.5) описывается экспериментальный протокол проницаемости. Рабочий процесс экспериментального протокола для измерения проницаемости препарата in vitro обобщен на рисунке 5. Рисунок 5: Рабочий процесс экспериментального протокола. Органоидная среда должна быть изменена с CMGF + R / G на CMGF + между восемью-двенадцатью днями после посева вкладышей, что позволяет проводить клеточную дифференциацию. После изменения среды (как апикальной, так и базолатеральной) на CMGF+, значения TEER все еще должны увеличиваться, при этом монослой собачьего органоида почти достигает слияния. По крайней мере, через четыре дня после смены среды на CMGF+, оценивается готовность монослоев. Когда монослой полностью сформирован, а значения TEER достигают фазы плато (обычно между 1 500 и 2 500Ω,см2), среда обменивается на транспортный буфер в течение 30 мин, чтобы позволить монослою приспособиться к новой среде. Во время 0 мин эксперимента проводится анализ FITC-декстрана, и 20 мин базолатеральный образец собирают. Результаты впоследствии анализируются на пластинчатом считывателе. После эксперимента содержимое апикальной и базолатеральной камеры снова изменяется на CMGF+, и снимаются показания значения TEER. Монослои инкубируют в течение 24 ч, а целостность монослоя оценивается путем повторных измерений TEER. Сокращения: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление; ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ; CMGF+ = Полная среда с факторами роста, но без ингибитора ROCK или GSKiβ; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; F = флуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Оценка готовности органоидного монослояПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап происходит через 8-14 дней после посева. Проверяйте монослой, по крайней мере, через день под световым микроскопом (используйте фазовый контраст для визуализации целостности монослоя). Переходите к следующему шагу, когда клеточный монослой полностью сформирован без зазоров или явных признаков разрывов. Изменить органоидную среду с CMGF+ R/G на CMGF+ (исключая ингибитор ROCK и GSKiβ из состава среды). Рекомендуется поменять среду по крайней мере за четыре дня до начала эксперимента.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволит правильно дифференцировать органоидный монослой. Продолжайте измерять значения TEER примерно через день. Когда значения TEER начинают стабилизироваться примерно на уровне от 1 500 до 2 000 Ω × см² (рисунок 6), измеряйте значения TEER каждый день.ПРИМЕЧАНИЕ: Это устойчивое состояние может поддерживаться в течение примерно 2-3 дней, что является оптимальным периодом времени для проведения испытаний на проницаемость (обычно в дни с 11 по 13). Значения плато TEER могут незначительно колебаться в зависимости от кишечной локализации органоидов, измерения температуры, породы, возраста и болезненного состояния собаки. Немедленно запланируйте анализ проницаемости препарата, чтобы избежать быстрого снижения значений TEER или разрастания органоидного монослоя в несколько клеточных слоев. Подготовка к экспериментуПРИМЕЧАНИЕ: Шейкеры инкубатора могут быть использованы во время эксперимента, чтобы избежать воздействия незатейливого слоя воды. Измеряйте значения TEER при постоянных температурах. В день эксперимента измерьте значения TEER и подтвердите, что значения достигли устойчивого состояния и не снижаются быстро. Выберите лучшие монослои (с помощью световой микроскопии и значений TEER) из избытка 20% вкладышей для выполнения эксперимента. Наблюдайте за монослоями под световым микроскопом и исключайте неполные, разорванные или разросшиеся органоидные монослои. Подготовьте транспортный буфер и отрегулируйте его pH до требуемых значений.ПРИМЕЧАНИЕ: Состав экспериментального буфера различается в зависимости от экспериментальной установки. Часто используемый буфер состоит из сбалансированного раствора соли Хэнка (HBSS), глюкозы (12,5 мМ) и 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES, 25 мМ). Такой состав обеспечивает жизнеспособность органоидной культуры во время эксперимента. Тщательно аспирируйте среду из апикальной и базолатеральной камер выбранных скважин. Добавьте 200 мкл транспортного буфера в апикальную камеру и 800 мкл в базолатеральную камеру.ПРИМЕЧАНИЕ: Транспортный буфер следует сначала добавить в апикальную камеру, а затем в базолатеральную камеру, чтобы избежать отделения монослоя от микропористой мембраны. Поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% CO2 атмосферы) на 30 минут, чтобы уравновесить.ПРИМЕЧАНИЕ: Собачьи органоидные монослои теперь готовы к эксперименту по проницаемости препарата. Типичная экспериментальная компоновка – концентрационный раствор IgYПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный дизайн и макет могут меняться в зависимости от исследовательского вопроса. Проницаемость иммуноглобулина Y (IgY) через органоидный монослой используется в протоколе в качестве примера и может быть модифицирована. Термин донорская камера относится к камере, в которой первоначально применяется лекарственное средство, в то время как приемная камера относится к камере, принимающей лекарство из донорской палаты. Типичный эксперимент собирает образцы в камерах приемника в течение 2 ч (например, 15, 30, 60, 90, 120 мин). Готовят раствор IgY (лекарственное средство или растворенное вещество по выбору), растворяя его в транспортном буфере до желаемой конечной концентрации. Приготовьте больше раствора препарата, чем необходимо.ПРИМЕЧАНИЕ: Лекарственные средства с низкой растворимостью в воде могут быть сначала растворены в органическом растворителе (например, этаноле, ДМСО) перед добавлением в буфер. Конечная концентрация растворителя должна быть менее 1%, чтобы не повредить клеточный монослой. Удалите буфер из донорской камеры (апикальной или базолатеральной камеры) каждой скважины. Добавьте раствор IgY (раствор лекарственного средства) во все донорские камеры. Используют оставшийся раствор в качестве времени 0 донорского раствора для измерения исходной концентрации препарата. В требуемые моменты времени извлеките 50 мкл из приемной камеры и поместите его в маркированную трубку. В последний момент времени извлеките образец из донорской палаты. В конце эксперимента перенесите аликвоты донора и приемника в морозильную камеру -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется много временных точек, замена буфера в приемной камере может быть произведена, но должна быть учтена при расчете кажущейся проницаемости. Концентрация в камере приемника не должна достигать более 10% донорской камеры в конце эксперимента для поддержания условий мойки44. Контроль качества монослоя органоидных клетокПРИМЕЧАНИЕ: Раствор FITC-декстрана может быть использован для подтверждения целостности монослоя во время эксперимента. FITC-декстран используется в качестве примера монослойного анализа целостности. Другие включают Люцифер желтый, PEG-4000, радиомаркированный маннит и инулин44. Во время 0 мин аспирируют содержимое апикальной камеры и заменяют 250 мкл раствора FITC-декстрана (5 мг/мл, 4 кДа) в трех экземплярах для каждой экспериментальной группы.ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте FITC-декстран воздействию света. Через 20 мин вынуть буфер из базолатеральной камеры. Измерьте интенсивность флуоресценции базолатерального образца с помощью считывателя флуоресцентных пластин (используйте калибровочную кривую; возбуждение установлено на 485 нм и значение излучения на 528 нм).ПРИМЕЧАНИЕ:Приложение P FITC также может быть рассчитано с использованием метода, описанного в обсуждении. После завершения эксперимента тщательно аспирируйте избыточный буфер из апикальной и базолатеральной камер. Добавьте 200 мкл CMGF+ в апикальную камеру и 700 мкл в базолатеральную камеру. Измерение значений TEER в отдельных скважинах. Поместите пластину в инкубатор (37 °C; 5% CO2 атмосферы) на 24 ч. Если применимо, через 24 ч измерьте значения TEER для оценки возможного повреждения монослоя во время части эксперимента, посвященной контролю качества. Используйте световую микроскопию для визуализации целостности монослоя собачьего органоида. Фиксация монослоев ячеек для последующего анализа Готовят раствор формалин-уксусная кислота-спирт (FAA, состав в таблице 1). Удалите транспортный буфер или CMGF+ из апикальной и базолатеральной камер с помощью пипетки P1000 или стерильных одноразовых 9-дюймовых пипеток Пастера и вакуумного аспиратора. Заполните апикальную и базальную камеры FAA. Через 24 ч аспирировать FAA и заменить его 70% этанолом. Оберните пластину гибкой лабораторной пленкой для предотвращения испарения и приступайте к блочной подготовке. Рисунок 6: Значения TEER в экспериментальных группах. Значения TEER были измерены в пяти группах монослоев органоидов кишечного кишечника собак. Три группы состояли из собачьих энтероидов тощей кишки, а две группы состояли из колоноидов. Каждая группа включала от 12 до 22 реплик. Значения TEER для точевидных энтероидных культур показаны с 4-го по 14-й день, а колоноидные культуры показаны с 4-го по 12-й день (измерения закончились, когда органоидный монослой достиг стационарных значений, что указывает на то, что монослой был готов к экспериментальному использованию). Полосы погрешностей выражают SEM измерений. Аббревиатура: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Стандартные операционные процедуры для культивирования собачьих органоидов были ранее описаны33, и Протокол органоидов собак также подробно обсуждался в этом специальном выпуске38. Кишечные органоиды собак, культивируемые на проницаемых опорах, были зафиксированы и парафин-внедрены для изучения микроанатомии монослоя и клеточных популяций. Процесс встраивания парафина ранее обсуждался Gabriel et al.38. Было выполнено рутинное окрашивание (гематоксилин и эозин), а метод окрашивания Alcian Blue был использован для обнаружения бокаловидных клеток в монослое органоидов собак (см. Рисунок 7). Рисунок 7: Однослойное окрашивание органоидов кишечника собак. Кишечные органоиды кишечника собак желудочного происхождения в проницаемой опоре были внедрены парафином и окрашены H&E и AB. Репрезентативные изображения были сделаны с использованием световой микроскопии при увеличении 40x (A) и 60x (B). Окрашивание H &E обнаруживает столбчатый эпителиальный монослой, а микроворсинки в апикальной части клеток можно наблюдать при 60-кратном увеличении. Окрашивание AB дополнительно раскрывает присутствие бокаловидных клеток (темно-синего цвета) в монослое органоидов кишечника собак. Шкала стержней = 20 мкм (A), 50 мкм (B). Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; AB = Алциан Синий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Органоидную культуру на проницаемой опоре следует выращивать в течение 10-14 дней, чтобы быть готовой к эксперименту по проницаемости. Световая микроскопия используется в сочетании с измерениями значений TEER для подтверждения готовности органоидной культуры к тестированию проницаемости лекарств-кандидатов. Репрезентативные световые микроскопические изображения различных органоидных монослоев кишечного кишечника у здоровых и больных животных представлены на рисунке 8. Рисунок 8: Органоидная монослойная микроскопия органоидов кишечных собак. Изображения растущих монослоев, видимые под световой микроскопией. Органоидные монослои, полученные от здоровых доноров, представлены тощей кишечной энтероидной (10x; 40x) и колоноидной (20x; 40x) культурами. Органоидные монослои больных доноров представлены дуоденальными (5x; 10x) и подвздошными (5x; 10x) энтероидами, полученными от собачьего пациента с диагнозом PLE. Обе органоидные культуры PLE являются примерами неправильной изоляции клеток во время посева органоидов, и эти культуры не могут быть использованы для анализа проницаемости лекарств из-за наличия 3D-органоидов. Примеры отклонений от правильного образования монослоя, такие как монослойные разрывы (5x), вызваны неосторожными манипуляциями с биологическими образцами. Длительная культивирование органоидов (10x; 20x) вызвана длительным содержанием органоидов на вкладыше, когда органоиды начинают напоминать свою первоначальную 3D-структуру. Для сравнения представлены изображения традиционных 2D клеточных линий на проницаемых носителях, обычно используемых для исследований проницаемости лекарственных средств (MDCK-10x; 40x и Caco-2-10x; 20x). Сокращения: PLE = белково-теряющая энтеропатия; MDCK = собачья почка Мадина-Дарби. Шкала стержней = 500 мкм (5x), 200 мкм (10x), 100 мкм (20x), 50 мкм (40x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Органоидные монослои также были зафиксированы в 3% параформальдегида-3% глутаральдегида в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS). Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) использовалась для характеристики ультраструктуры органоидной культуры на проницаемых опорах. Микроанатомические структуры микроворсинок и плотных соединений можно увидеть на рисунке 9. Рисунок 9: Теам изображения здоровых органоидных монослоев кишечного кишечника. ТЭМ был использован для выявления клеточной микроархитектуры точевидных (A), подвздошных (B) и толстоковидных (C) органоидных монослоев. Микропористая мембрана проницаемой опорной вставки отмечена желтой стрелкой. Наличие микроворсинок (синяя стрелка) и плотных соединений (красная стрелка) очерчено на изображениях. Аббревиатура: TEM = Просвечивающая электронная микроскопия. Шкала стержней = 5 мкм (А), 2 мкм (В, С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Как измерения TEER, так и световая микроскопия должны быть выполнены для обеспечения готовности системы к испытаниям на проницаемость. Анализ готов к использованию, когда TEER достигает устойчивого состояния, в то время как световая микроскопия поможет исключить повреждение или чрезмерный рост органоидов. Резюме типичных измерений TEER пяти групп, состоящих из собачьих энтероидов и колоноидов, представлено на рисунке 6. Таблица 1: Состав органоидных сред и FAA. Полный состав CMGF+, CMGF+ R/G и FAA обобщен в этой таблице. Сокращения: ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ; CMGF+ = Полная среда с факторами роста, но без ингибитора ROCK или GSKiβ; FAA = формалин-уксусная кислота-спирт; EGF = эпидермальный фактор роста. Эта таблица адаптирована из 38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу. Дополнительная таблица 1: Таблица для учета собачьего органоида проницаемой опорной системы. Сокращения: TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление; ROCK = ро-ассоциированная киназа; GSKiβ = гликогенсинтаза киназа бета; CMGF + R/G = Полная среда с факторами роста, усиленными ингибитором ROCK и GSKiβ; CMGF+ = Полная среда с факторами роста, но без ингибитора ROCK или GSKiβ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Кишечные органоидные культуры собак в проницаемом опорном аппарате представляют собой уникальную концепцию, связывающую традиционные анализы проницаемости лекарственного средства⁴⁰ с новой моделью⁴¹ собак in vitro. Различные типы органоидов кишечника собак могут быть использованы и оценены на основе цели эксперимента с минимальными корректировками. Рекомендуется тестирование многократных концентраций интересующего препарата в 3-4 лунках на группу. Концентрации могут основываться на ожидаемой кишечной концентрации препарата. Кроме того, использование предыдущих исследований может помочь определить подходящие временные точки для дизайна исследования. Для повышения воспроизводимости и помощи в устранении неполадок должна быть подготовлена соответствующая документация по дизайну исследования.

Эта технология имеет несколько ограничений из-за новизны метода⁴², в основном из-за отсутствия стандартизации в экспериментальном проектировании и выполнении протокола в лабораториях. Это отсутствие стандартизации было признано другими группами⁴³, и протоколы 3D-органоидных монослоев для собак приведут к межлабораторной воспроизводимости и введут стандартизацию в эту систему. Стандартизированные подходы к анализу данных улучшают воспроизводимость и могут усилить результаты предварительного тестирования лекарств с использованием собачьих органоидов в системе проницаемых опор в различных лабораториях. В собачьей 3D-органоидной модели также отсутствуют наборы данных, сравнивающие значения in vitro P_app модельных препаратов с их известной кишечной абсорбцией человека или собаки in vivo, подобно клеткам Caco-2 44,45,46. После того, как такие данные были сгенерированы, эта собачья органоидная модель может быть использована для оценки кишечной проницаемости во время разработки препарата.

Крайне важно соблюдать осторожность при посеве органоидов на проницаемую опорную систему, чтобы засеять достаточно высокую плотность соответствующим образом диссоциированных клеток. Значения TEER системы более надежны и воспроизводимы при выращивании в строгих монослоях. Длительное культивирование монослоев может привести к экспоненциальному увеличению значений TEER, достигающих дальнейших физиологических значений кишечника. H&E участки таких 3D-структур затем показывают несколько слоев клеток друг над другом с измененными структурами энтероцитов ближе к мембране.

После успешного расширения монослоя органоидов кишечного кишечника для собак результаты могут быть проанализированы таким же образом, как и традиционные 2D-клеточные анализы, путем расчета коэффициента кажущейся проницаемости лекарственного средства (_{P app}) формулы⁴⁴. Значение_{приложения} P (см. Eq (2)) описывает скорость транспорта через сотовый монослой⁴⁷.

(2)

Начальный наклон концентрации по отношению к кривой времени (например, нмоль/с). A – площадь вкладыша (^см2), а C₀ – начальная концентрация лекарственного средства или соединения в донорской камере³⁷. Надежное распознавание целостности монослоя является важной частью анализа проницаемости, требующего стандартизации. Световая микроскопия и измерения TEER рекомендуются для оценки органоидов собак в проницаемой системе поддержки и помогают определить правильное время эксперимента. Кроме того, маркеры нулевой молекулярной проницаемости (например, FITC-декстран, Люцифер желтый, PEG-400) могут быть использованы для функциональной оценки целостности монослоя органоида. Следует обратить внимание, если испытываемое соединение подвергается воздействию транспортера. P-гликопротеин (P-gp) используется в качестве общего примера эффлюксного насоса. Коэффициент эффлюкса должен быть сгенерирован (_{приложение P, приложение BL-AP} / P_{, ap-BL}) со сравнением с хорошо известной подложкой зонда P-gp.

Световая микроскопия (простая или усиленная фазовым контрастом) является бесценным методом проверки целостности 2D или 3D монослоя и фильтрующей вставки при оценке возможного клеточного разрастания. Рисунок 7 может служить руководством по распознаванию здоровых культур органоидных клеток кишечного кишечника. Значения TEER являются важной мерой образования межклеточных соединений и дифференцировки органоидных культур в интактный эпителий кишечника. Органоиды кишечного кишечника собак дифференцируются в энтероциты и бокаловидные клетки (рисунок 6). Эти клетки, продуцирующие слизь, позволяют изучать взаимодействие лекарств и слизи, чего было трудно достичь с использованием традиционных 2D-клеточных культур⁴⁸. Наличие энтероэндокринных клеток было ранее подтверждено в органоидах кишечника собак Chandra et ^al.33.

Дана дальнейшая характеристика собачьих органоидных монослоев, полученных из тощей кишки, подвздошной и толстой кишки с использованием ТЭМ. Изображения TEM показывают клеточную микроархитектуру, включая плотные соединения и образование микроворсинок, дополнительно иллюстрируя сложность и полезность этих органоидных моделей в трансляционной медицине. Основываясь на экспериментальных результатах, органоидные культуры на проницаемой опоре были готовы к экспериментам между 11 и 13 днями после посева (рисунок 9). Значения TEER на данный момент времени варьировались от 1 500 до 2 500^Ω,см2. Фаза плато значений TEER длится в течение очень ограниченного периода времени, когда эксперимент должен быть начат до того, как значения TEER начнут медленно снижаться. Значения TEER также могут быть важной частью отображения важных экспериментальных результатов, поскольку некоторые лекарственные средства или вспомогательные вещества лекарственного средства могут взаимодействовать с монослоем (например, плотными соединениями), что может значительно влиять на показания значений TEER. Это само по себе может служить данными для эксперимента.

Органоиды кишечного кишечника собак в двухкамерном клеточном культуральном аппарате могут применяться в областях, отличных от пероральной проницаемости лекарственного средства, из-за уникальной архитектуры результирующего клеточного монослоя. Например, они могут быть использованы в микробиологических исследованиях (например, влияние изменения микробной флоры ЖКТ), исследованиях поглощения вирусов, лекарственно-лекарственных взаимодействий и механизмов переноса лекарств⁴⁹. Донорская камера обычно заполняется испытуемым лекарственным средством или соединением по выбору, и аликвоты из камеры приемника берутся в различные моменты времени. Эти аликвоты могут быть проанализированы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, иммуноферментного анализа или других методов для определения количества и скорости, с которой растворенное вещество проникает через монослой.

Эти исследования требуют интактного монослоя для точной оценки проницаемости препарата. Это, как правило, требует выращивания монослоев сверх тех, которые необходимы для учета непригодных для использования скважин. Монослои органоидных клеток также могут быть использованы для измерения поглощения вируса либо с апикальной, либо с базальной стороны монослоя, с показаниями, включая иммунофлуоресцентные антитела, использующие антитела для обнаружения клеточного поглощения вируса. Наконец, несколько лекарств (т.е. субстрат и ингибитор) могут быть применены к донорской камере для идентификации лекарственно-лекарственных взаимодействий на основе транспортера.

Основываясь на текущих наблюдениях, эти методы будут не только применимы к собачьим органоидам в культуральных вставках, но также будут пригодны для других ветеринарных видов и систем органов с незначительными изменениями, необходимыми для наилучшего соответствия выбранному виду или модели органа. Протоколы роста органоидов кишечного кишечника собак должны были быть скорректированы на основе уникальных свойств культуры. Таким образом, протокол может быть адаптирован к другому виду, но потребует тонких изменений в протоколе. Модификации могут начинаться с изменения плотности посева клеток и расширяться до изменений в составе среды, чтобы правильно дифференцировать органоиды, представляющие интерес.

Стандартизация, подробная документация экспериментальных процедур и последовательный мониторинг клеточных монослоев являются важнейшими практиками, необходимыми для проницаемых опорных анализов, и не ограничиваются собачьей системой. Эти возможные виды или модификации органов имеют решающее значение для документирования и отчетности о дальнейших достижениях в этой области. Эта модель имеет несколько ограничений, например, ее требования к стоимости, межлабораторную изменчивость и ограниченные данные о способности прогнозировать кишечную абсорбцию in vivo. Собаки, в некоторых случаях, обладают другими транспортерами лекарств и метаболизирующими ферментами, чем люди⁵⁰.

Кроме того, собачья органоидная система должна быть испытана на множестве других двухкамерных аппаратов других производителей для определения пригодности такой модели (например, должна быть определена пригодность различных составов фильтрующих мембран). Другим недостатком является то, что экспериментальная часть рукописи, посвященная лекарственной проницаемости, является менее описательной, чем предыдущие части. Это вызвано избытком информации в этой области. Цель этой части рукописи состояла в том, чтобы описать эти методы модифицируемым образом, не разрезая края краеугольных камней этих экспериментов. Более подробная информация об экспериментах с проницаемостью была собрана Hubatsch et ^al.37. Кроме того, проницаемые вставки могут быть использованы в экспериментах по кокультуре, миграции клеток и анализу инвазии⁴.

В заключение, органоиды кишечника собак в двухкамерных культуральных аппаратах имеют потенциал для использования в широком спектре применений, включая биомедицинские области и трансляционную медицину, чтобы назвать несколько. Протоколы создают несколько стратегий для планирования эксперимента и способствуют надежности межлабораторных данных для органоидных моделей в области биологии.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Хотим выразить благодарность сотрудникам Ветеринарно-диагностической лаборатории Университета штата Айова, а именно Хейли Ламберт, Эмили Рахе, Розалин Бранаман, Виктории Грин и Дженнифер Грольц-Дрозд, за своевременную обработку образцов. Мы также хотели бы поблагодарить Джоди Смит и Бетанн Валентайн за предоставление материала для экспериментов по проницаемости. Мы также хотим поблагодарить Дэвида Диас-Реганона за его помощь с рисунком 9. За исключением рисунка 6, все фигуры были созданы в BioRender.com. Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award и NSF SBIR subaward to ISU # 1912948.

Materials

Organoid media
ROCK inhibitor (Y-27632)	EMD Millipore Corp.	SCM 075
[Leu¹⁵]-Gastrin I human	Sigma	G9145-.5MG
A-83-01	PeproTech	9094360
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
FBS	Corning	35-010-CV
Glutamax	Gibco	35050-061	glutamine substitute
HEPES	VWR Life Science	J848-500ML
Human R-Spondin-1	PeproTech	120-38-500UG
Murine EGF	PeproTech	315-09-1MG
Murine Noggin	PeproTech	250-38-250UG
Murine Wnt-3a	PeproTech	315-20-10UG
N2 supplement	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-25G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
SB202190 (P38 inhibitor)	Sigma	S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β)	Reprocell	04-0004-base
TMS (trimethoprim sulfate)	Sigma	T7883-5G
Reagents
Acetic Acid, Glacial	Fisher Chemical	A38-500
alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous	Acros Organics	170080010
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL	Gibco	A10483-01
FITC-CM-Dextran	Millipore Sigma	68059-1G
Formaldehyde (37%)	Fisher Chemical	F79P-4
Glutaraldehyde solution	Sigma	G5882
HBSS (1x)	Gibco	14025-076
Matrigel Matrix For Organoid Culture	Corning	356255	Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97%	Alfa Aesar	A11313
PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)	Corning	21-040-CM
TrypLE Express	Gibco	12604-021	Trypsin-like Protease
Materials and Equipment
15 mL Centrifuge Tube	Corning	430766
9" Pasteur Pipets	Fisherbrand	13-678-6B
Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 µm, Sterile	Corning	3470	Permeable Support
Millicell ERS (Probes)	Millipore Sigma	MERSSTX01
Millicell ERS-2 Voltohmmeter	Millipore Sigma	MERS00002
Panasonic incubator	Panasonic	MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film	Bemis Company Inc	PM996/EMD	Flexible Laboratory Film
Tissue Culture Plate 24 wells	Fisherbrand	FB012929

References

Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments JoVE. (80), e50638 (2013).
Youhanna, S., Lauschke, V. M. The Past, present and future of intestinal in vitro cell systems for drug absorption studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (1), 50-65 (2021).
Belic, S., et al. Comparative analysis of inflammatory cytokine release and alveolar epithelial barrier invasion in a transwell®bilayer model of mucormycosis. Frontiers in Microbiology. 3204, 3204 (2019).
Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51046 (2014).
Rönkkö, S., Vellonen, K. S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411 (2019).
Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
Natoli, M., Leoni, B. D., D’Agnano, I., Zucco, F., Felsani, A. Good Caco-2 cell culture practices. Toxicology in Vitro. 26 (8), 1243-1246 (2012).
Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
Chandler, M., et al. Obesity and associated comorbidities in people and companion animals: a One Health perspective. Journal of Comparative Pathology. 156 (4), 296-309 (2017).
Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
Galeta, P., Lázničková-Galetová, M., Sablin, M., Germonpré, M. Morphological evidence for early dog domestication in the European Pleistocene: New evidence from a randomization approach to group differences. Anatomical Record. 304 (1), 42-62 (2021).
Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nature Reviews Endocrinology. 14 (3), 140-162 (2018).
Allenspach, K., Wieland, B., Gröne, A., Gaschen, F. Chronic enteropathies in dogs: Evaluation of risk factors for negative outcome. Journal of Veterinary Internal Medicine. 21 (4), 700-708 (2007).
Wang, J., et al. Proliferative and invasive colorectal tumors in pet dogs provide unique insights into human colorectal cancer. Cancers. 10 (9), 330 (2018).
Gillespie, V., Baer, K., Farrelly, J., Craft, D., Luong, R. Canine gastrointestinal stromal tumors: Immunohistochemical expression of CD34 and examination of prognostic indicators including proliferation markers Ki67 and AgNOR. Veterinary Pathology. 48 (1), 283-291 (2011).
Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: the One Health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
Artursson, P., Palm, K., Luthman, K. Caco-2 monolayers in experimental and theoretical predictions of drug transport. Advanced Drug Delivery Reviews. 22 (1-2), 67-84 (1996).
Balimane, P. V., Han, Y. H., Chong, S. Current industrial practices of assessing permeability and P-glycoprotein interaction. AAPS Journal. 8 (1), 1-13 (2006).
Sambuy, Y., et al. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
Calcagno, A. M., Ludwig, J. A., Fostel, J. M., Gottesman, M. M., Ambudkar, S. V. Comparison of drug transporter levels in normal colon, colon cancer, and caco-2 cells: Impact on drug disposition and discovery. Molecular Pharmaceutics. 3 (1), 87-93 (2006).
Hilgendorf, C., et al. Expression of thirty-six drug transporter genes in human intestine, liver, kidney, and organotypic cell lines. Drug Metabolism and Disposition. 35 (8), 1333 (2007).
Seithel, A., Karlsson, J., Hilgendorf, C., Björquist, A., Ungell, A. L. Variability in mRNA expression of ABC- and SLC-transporters in human intestinal cells: Comparison between human segments and Caco-2 cells. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (4), 291-299 (2006).
Volpe, D. A. Transporter assays as useful in vitro tools in drug discovery and development. Expert Opinion on Drug Discovery. 11 (1), 91-103 (2016).
Hoffmann, P., et al. Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells. PLoS ONE. 16 (10), 257824 (2021).
Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
Thummel, K. E., et al. Transcriptional control of intestinal cytochrome P-4503A by 1α,25-dihydroxy vitamin D3. Molecular Pharmacology. 60 (6), 1399-1406 (2001).
Kodama, N., et al. Characteristic analysis of intestinal transport in enterocyte-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. Drug Metabolism and Disposition. 44 (10), 1662-1667 (2016).
Akazawa, T., et al. Application of intestinal epithelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells for studies of prodrug hydrolysis and drug absorption in the small intestine. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 46 (11), 1497-1506 (2018).
Lo, B., Parham, L. Ethical issues in stem cell research. Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).
Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).
Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (179), e63515 (2022).
Frost, T. S., Jiang, L., Lynch, R. M., Zohar, Y. Permeability of epithelial/endothelial barriers in transwells and microfluidic bilayer devices. Micromachines. 10 (8), 533 (2019).
van Breemen, R. B., Li, Y. Caco-2 cell permeability assays to measure drug absorption. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 1 (2), 175-185 (2005).
Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
Olivatti, T. O. F., Alcantara, G. P., Lemos, A. C. C. E., Silva, M. G., Miot, H. A. Standardization of organoid culture for evaluation of melanogenesis induced by UVB, UVA and visible light. Anais Brasileiros de Dermatologia. 95 (1), 46-51 (2020).
Volpe, D. A., et al. Classification of drug permeability with a Caco-2 cell monolayer assay. Clinical Research and Regulatory Affairs. 24 (1), 39-47 (2007).
Chen, C., Ma, M. G., Fullenwider, C. L., Chen, W. G., Sadeque, A. J. M. Biopharmaceutics permeability classification of lorcaserin, a selective 5-hydroxytryptamine 2C agonist: Method suitability and permeability class membership. Molecular Pharmaceutics. 10 (12), 4739-4745 (2013).
Jarc, T., et al. Demonstrating suitability of the Caco-2 cell model for BCS-based biowaiver according to the recent FDA and ICH harmonised guidelines. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 71 (8), 1231-1242 (2019).
Newby, D., Freitas, A. A., Ghafourian, T. Decision trees to characterise the roles of permeability and solubility on the prediction of oral absorption. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 751-765 (2015).
Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS ONE. 8 (7), 68761 (2013).
Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
Martinez, M. N., Mochel, J. P., Neuhoff, S., Pade, D. Comparison of canine and human physiological factors: understanding interspecies differences that impact drug pharmacokinetics. The AAPS Journal. 23 (3), 59 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gabriel, V., Zdyrski, C., Sahoo, D. K., Dao, K., Bourgois-Mochel, A., Atherly, T., Martinez, M. N., Volpe, D. A., Kopper, J., Allenspach, K., Mochel, J. P. Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System. J. Vis. Exp. (181), e63612, doi:10.3791/63612 (2022).