デュアルチャンバー透過性サポートシステム内の犬腸オルガノイド

この研究は、アイオワ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC-19-337;IACUC-18-065;IACUC-19-017)。次のセクション (ステップ 1.1 ~ 1.3) では、透過性サポート シード プロトコルについて説明し、その手順を 図 3 にまとめます。 図3:透過性サポートシーディングプロトコルのワークフロー。 透過性支持体インサートは、CMGF+ R/G、コラーゲンI、および細胞外膜マトリックスの組み合わせでプレコーティングされ、続いてインキュベートされる。イヌオルガノイド培養物からの培地を吸引し、細胞回収溶液に交換し、続いて4°Cで30分間インキュベートした。 続いて培養物をチューブに移し、トリプシン様プロテアーゼを用いてオルガノイド解離を行う。解離していないオルガノイドは、ストレーナーを通過することによって除去され、単一細胞懸濁液を達成し、細胞濃度は血球計数器または自動細胞カウンターを使用して決定される。細胞を透過性支持体インサート上に播種し、CMGF+ R/Gを基底側チャンバーに添加する。次いで、培養物を24時間インキュベートし、残りの液体を頂端チャンバーから除去し、CMGF+ R/Gと置換する。GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;CMGF + R/G = ROCK阻害剤およびGSKiβで強化された成長因子を含む完全培地。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1. 透過性サポートシーディングプロトコル 透水性支持体インサートのプレコーティング 表1の情報に従って、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤およびグリコーゲン合成酵素キナーゼβ阻害剤(GSKiβ)(CMGF+R/G)で増強された成長因子を含む完全な培地を調製する。 氷バケツを準備し、氷上で細胞外膜マトリックスを融解し始める。必要な数のインサートを含む24ウェルプレートをインキュベーターに入れ、予温します。ラット尾コラーゲンI(3mg/mL)を集め、光から守りながら氷の上に置きます。CMGF + R / Gを収集し、氷の上に置きます。 実験に必要なインサートとブランクの総数を計算し、インサートごとに100μLのコーティング溶液を脇に置いておきます。注:必要以上にコーティング溶液を調製してください。必要以上に少なくとも15%多く準備することをお勧めします。 15mLチューブで、CMGF+ R/Gを細胞外膜マトリックス(1%)およびコラーゲンI(1%)と混合し、穏やかにピペットミックスする。 各ポリエステルインサートを100μLのコーティング溶液でコーティングし、インサートをインキュベーター(37°C;5%CO2 雰囲気)に1時間置きます。 インキュベーション後、インサートフィルターを乱さないように注意しながら、真空アスピレーターまたはP1000ピペットを使用して、コーティング溶液を各インサートから慎重に吸引します。プレコートプレートをインキュベーターに入れて保温します。 犬のオルガノイド解離注:少なくとも4日間培養された犬のオルガノイドを使用してください。解離を開始する前に、Gabriel et al.38 を参照して、サンプルが健康で、密度が高く、実験に十分である時期を判断してください。すべてのウェルメッキ手順のためにオルガノイドの1つの余分なウェルを解離することが推奨される。さらに、不均一なオルガノイドの成長または不適切な操作によって引き起こされる損傷を説明するために、所望の挿入数を〜20%増加させることが推奨される。FITCデキストランの使用を計画している場合は、余分な井戸を準備してください。 アイスバケツと冷たい1x Advanced DMEM/F12ストックのバイアルをバイオセーフティキャビネットに用意します。 細胞外膜マトリックスを氷の上に置き、融解を開始し、急速な融解から保護し、凝固を避けるために氷に沈める。細胞外膜マトリックスのめっきのために冷凍庫にピペットチップ(P200)の箱を置く。 冷蔵遠心分離機を4°Cに予冷する。 CMGF+ R/Gを冷凍庫/冷蔵庫から37°Cのウォーターバスに移動します。可能な限り、直接光への暴露を避けてください。 細胞外膜マトリックスを乱さないように注意しながら、適切な数のウェル(24ウェルプレートの1ウェルあたり2〜4インサート)のオルガノイド培養で24ウェルプレートからすべての培地を除去します。メモ: この容量は、使用するセル計数システムによって異なる場合があります。 ウェルあたり0.5 mLの予備冷却細胞回収溶液を加え、細胞外膜マトリックスドームを溶解する。 プレートを冷蔵庫(4°C)中で30分間インキュベートする。 懸濁液をピペットでピペットし、すべてのオルガノイドを回収し、細胞外膜マトリックスを溶解し、それらを15mLチューブに移す。 遠心分離機(700 × g 、4°Cで5分間)し、レベルが0.5 mLマークに達するまで上清を除去し、ペレットを乱さないようにした。 1mLのトリプシン様プロテアーゼを加え、37°Cの水浴中で8分間インキュベートする。インキュベーション期間中にチューブを数回フリックして細胞を混合する。 サンプルの入ったチューブをバイオセーフティキャビネットに移し、7 mLのプレチルドアドバンストDMEM/F12をゆっくりと加えて、トリプシン様プロテアーゼを不活性化し、細胞解離を停止します。 40 μm セルストレーナーを 1 mL のアドバンスト DMEM/F12 でプリウェットします。混合物を静かにピペッティングし、懸濁液を濾過する。追加の高度なDMEM/F12をピペットでつないでストレーナーをすすいでください。 チューブ(700 × g を4°Cで5分間)遠心分離し、上清を除去する。ペレットを乱さないでください。 細胞ペレットを、分離したオルガノイドのウェルごとに約50〜100μLの培養培地(CMGF+ R/G)に再懸濁する。 血球計数器または適切な機械を使用して懸濁液のサブサンプル(〜10μL)をカウントし、懸濁液中の総細胞数を決定する。 犬のオルガノイド播種 細胞懸濁液を希釈または濃縮し、1mLあたり〜75,000細胞の細胞濃度を得る。 移入中の細胞接着を避けるために、BSA(1%)プレコートチップを使用して懸濁液の種子100μLを各インサートに注入する。コーティングされたインサートを無細胞ブランクとして1つ追加し、オルガノイドが成長することなく、定期的な培地交換を受けます。 プレートを円運動で約30秒間静かに旋回させ、播種した細胞をインサート全体に分散させます。細胞の均一な分布を光学顕微鏡で確認する。 700 μL の CMGF + R/G を側底チャンバーに加え、プレートをインキュベーター (37 °C; 5% CO2 雰囲気) に24 時間置きます。 24 時間後、頂端チャンバーから細胞懸濁液を静かに取り出し、200 μL の CMGF + R/G と交換します。プレートをインキュベーターに戻します。 2. オルガノイド細胞単層維持プロトコル メモ: 次のセクション(手順 2.1-2.2)では、オルガノイド細胞単層維持プロトコルについて説明します。このプロトコルで紹介する手順のワークフローを 図 4 にまとめます。TEER値測定の標準化に役立つメモを取るための表を 補足表1に示します。 図4:透水性支持培養維持のワークフロー TEER値は、電極(プローブ)とボルト/オームメーターを使用して測定されます。プローブは、ウェルに挿入する前に70%のアルコールで化学的に滅菌する必要があります。ブランクおよびオルガノイドセルインサートが測定され、TEER値が計算されます。培地はその後、頂端チャンバーおよび側底チャンバーの両方でリフレッシュされ、インサート上のイヌオルガノイド培養物を光学顕微鏡を用いて可視化する。オルガノイド培養物または微多孔性膜のいずれかの涙は、プロトコルに従って記録され、取り扱われる。略語:TEER =経上皮電気抵抗。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 TEER値測定注:TEER値の測定は、箸が取り付けられた上皮ボルト/オームメーターを使用して行われます。製造元の取扱説明書を参照してください。TEER値は、犬のオルガノイド単層の完全性に関する情報を提供します。 細胞培養増殖中の代替日ごとにTEER値測定を行います。 上皮ボルト/オームメーターとその電極をバイオセーフティキャビネットに移動します。使用前に電極を70%アルコールで化学的に滅菌してください。関数をオームに設定します。電極が乾くまで少なくとも1分間待ちます。 最初の測定を行う前に、ワイヤ電極をポートに挿入し、電源を入れます。メーターに、箸を測定する代わりにワイヤー電極インサートで 1,000 個のΩが表示されることを確認します。そうでない場合は、デバイスを調整します。 無細胞インサート(ブランク)の頂端チャンバと側底チャンバに電極を挿入し、頂端チャンバに短い電極が含まれ、側底チャンバに長い電極が含まれるようにします( 図4を参照)。膜に触れないでください、しかし同時に、電極が媒体に沈んでいることを確認してください。 値が安定するまで数秒間待ってから、ラボブックにその値を書き留めます。残りの犬のオルガノイド単層を測定し、異なるサンプルを測定するときは、電極を70%アルコールで滅菌してください。電極でオルガノイド単層に触れないように注意してください。 測定が行われた後、最後に電極を70%アルコールで滅菌します。不適切な操作による損傷から保護し、製造元の指示に従って保管してください。 Eq (1) を使用して各ウェルの TEER 値を計算します。ここで、Rサンプル と R ブランクは、それぞれ単層ウェルとブランク ウェルのオーム (Ω) 値であり、面積 (cm²) はインサートの値です。 (1) 単層維持メモ: 表 2 の推奨媒体変更計画を確認します。 滅菌使い捨て9インチパスツールピペットと真空アスピレーターを使用して、頂端から培地を静かに吸引し、次に側底チャンバーから吸引します。プレートを傾けて、媒体の表面をはっきりと確認します。細胞単層の損傷を防ぐために、頂端チャンバ内の微多孔膜に近づきすぎないように吸引しないでください。注: サンプル間を移動するときは、新しいパスツールピペットを使用してください。ピペットもこの手順の代替品として使用できます。 頂端または側底チャンバーの壁を狙ったP1000ピペットを使用してCMGF+ R / Gをゆっくりと加えます。単分子層の損傷を避けるために、頂端チャンバー内の培地交換を非常に慎重に行う。 光学顕微鏡下で1日おきにウェルをチェックし、培養物の健康状態を評価し、オルガノイド単層または微多孔膜の涙液を監視します。位相差顕微鏡を使用して、培養物の詳細を強調します。注:犬のオルガノイド単層涙液の場合、単層には回復して再成長する時間が与えられます。微多孔膜涙液の場合、ウェルは実験から除外されなければならない。 表2:オルガノイド培養物に対する培地交換の推奨値。 CMGF+ R/Gは、代替日ごとに1日おきにウェルの頂端および側底チャンバー内で変化します。週末の培養期間が長くなるほど、側底チャンバーと頂端チャンバーの両方で培地量の増加が必要となり、金曜日の午後に適用され、月曜日に交換されます。略語:ROCK = rho関連キナーゼ;GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;CMGF + R/G = ROCK阻害剤およびGSKiβで強化された成長因子を含む完全培地。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. 透過性実験プロトコール メモ: 次のセクション(ステップ 3.1-3.5)では、透過性実験プロトコルについて説明します。薬物の インビトロ 透過性を測定するための実験プロトコルワークフローを 図5にまとめます。 図5:実験プロトコールのワークフローオルガノイド培地は、インサートを播種してから8〜12日後にCMGF+ R/GからCMGF+に変更しなければならず、細胞分化を可能にする。培地(頂端および側底側の両方)をCMGF+に変更した後も、TEER値は依然として増加しており、犬のオルガノイド単層はほぼコンフルエントに達しているはずです。培地がCMGF+に変更されてから少なくとも4日後に、単層の調製性が評価される。単層が完全に形成され、TEER値がプラトー相(典型的には1,500〜2,500 Ω.cm2の間)に達すると、培地は輸送バッファーと30分間交換され、単層が新しい環境に適応できるようにします。実験の時間0分で、FITC−デキストランアッセイが行われ、そして20分の側底側サンプルが収集される。結果はその後、プレートリーダーで分析されます。実験後、頂端チャンバーおよび側底チャンバーの内容物を再びCMGF+に変更し、TEER値の読み取り値を取得します。単層を24時間インキュベートし、単層の完全性をTEER測定の繰り返しによって評価する。略語:TEER =経上皮電気抵抗;ROCK = rho関連キナーゼ;GSKiβ=グリコーゲン合成酵素キナーゼβ;CMGF + R/G = ROCK阻害剤およびGSKiβで強化された成長因子を含む完全培地;CMGF+ = 成長因子を含むが、ROCK阻害剤またはGSKiβを含まない完全培地;FITC=フルオレセインイソチオシアネート;F = 蛍光。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 オルガノイド単層レディネスの評価注:この手順は、シード後8〜14日で行われます。 少なくとも1日おきに光学顕微鏡で単層を確認してください(位相差を使用して単層の完全性を視覚化します)。細胞単層が隙間や涙の明らかな兆候なしに完全に形成されたら、次のステップに進みます。 オルガノイド培地をCMGF+ R/GからCMGF+に変更する(培地組成物からROCK阻害剤およびGSKiβを除く)。実験の少なくとも4日前に培地を交換することが推奨される。注:このステップにより、オルガノイド単層の適切な分化が可能になります。 ほぼ 1 日おきに TEER 値の測定を続けます。TEER値が約1,500~2,000 Ω × cm²(図6)で頭打ちになり始めたら、毎日TEER値を測定します。メモ:この定常状態は約2〜3日間維持でき、これは透過性試験を実行するのに最適な時間枠です(通常は11〜13日目)。プラトーTEER値は、オルガノイドの腸内局在、測定温度、犬種、年齢、および疾患状態に基づいてわずかに振動する可能性がある。 TEER値の急速な低下またはオルガノイド単層の複数の細胞層への過増殖を避けるために、薬物透過性アッセイを直ちにスケジュールする。 実験の準備注:インキュベーターシェーカーは、攪拌されていない水層の影響を避けるために、実験中に使用することができます。一貫した温度でTEER値を測定します。 実験当日、TEER値を測定し、値が定常状態に達し、急激に低下していないことを確認します。 実験を実行するために、20%を超えるインサートから(光学顕微鏡およびTEER値を介して)最良の単層を選択する。 光学顕微鏡下で単層を観察し、不完全、破れた、または成長したオルガノイド単層を除外する。 輸送バッファーを準備し、そのpHを所望の値に調整します。注:実験バッファーの組成は、実験セットアップによって異なります。頻繁に使用されるバッファーは、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、グルコース(12.5 mM)、および4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES、25 mM)で構成されています。この組成物は、実験中のオルガノイド培養の生存率を保証する。 選択したウェルの頂端チャンバーおよび基底チャンバーから培地を慎重に吸引します。 200 μLの輸送バッファーを頂端チャンバーに、800 μLを側底チャンバーに加える。注:輸送バッファーは、微多孔膜からの単層の剥離を避けるために、最初に頂端チャンバーに添加し、次に基底側チャンバーに追加する必要があります。 プレートをインキュベーター(37°C;5%CO2 雰囲気)に30分間置き、平衡化した。注:犬のオルガノイド単層は、薬物透過性実験の準備が整いました。 典型的な実験レイアウト-IgY濃度溶液注:実験計画とレイアウトは、研究課題によって異なる場合があります。オルガノイド単分子膜を介した免疫グロブリンY(IgY)の透過性は、例としてプロトコルにおいて使用され、修飾され得る。ドナーチャンバーという用語は、薬物が最初に適用されるチャンバーを指し、一方、受容チャンバーは、ドナーチャンバーから薬物を受け入れるチャンバーを指す。典型的な実験では、2時間(例えば、15、30、60、90、120分)にわたって受信機チャンバー内のサンプルを収集します。 IgY溶液(選択した薬物または溶質)を所望の最終濃度まで輸送緩衝液に溶解して調製する。必要以上に薬液を調製する。注:水溶解度の低い薬物は、緩衝液に添加する前に、まず有機溶媒(例えば、エタノール、DMSO)に溶解させることができる。溶媒の最終濃度は、細胞単層を損傷しないように1%未満にすべきである。 各ウェルのドナーチャンバー(頂端チャンバーまたは側底チャンバーのいずれか)からバッファーを除去します。 IgY溶液(薬物溶液)をすべてのドナーチャンバーに加える。残りの溶液を初期薬物濃度の測定のための時間0ドナー溶液として使用する。 必要な時点で、50 μLを受容室から取り出し、ラベル付きチューブに入れます。最後の時点で、ドナーチャンバーからサンプルを取り出します。実験の終わりに、ドナーおよびレシーバーアリコートを-20°Cの冷凍庫に移す。メモ:多くの時間ポイントが必要な場合は、受信チャンバ内のバッファの交換を行うことができますが、見かけの透磁率の計算では考慮する必要があります。受信機チャンバ内の濃度は、シンク条件44を維持するために実験の終了時にドナーチャンバの10%を超えてはならない。 オルガノイド細胞単層品質管理注:FITC−デキストラン溶液は、実験中に単層完全性を確認するために使用することができる。FITC−デキストランは、単層完全性アッセイの一例として使用される。その他には、ルシファーイエロー、PEG-4000、放射性標識マンニトール、イヌリン44などがあります。 時間0分で、頂端チャンバーの内容物を吸引し、各実験群の3連で250μLのFITC−デキストラン溶液(5mg/mL、4kDa)と交換する。メモ: FITCデキストランを光にさらさないでください。 20分後、側底チャンバーから緩衝液を除去する。 蛍光プレートリーダーを用いて側底側サンプルの蛍光強度を測定する(検量線を使用;励起は485nmに設定し、発光値は528nmに)。注:FITCのPアプリは 、ディスカッションで説明した方法を使用して計算することもできます。 実験が終了した後、頂端チャンバーおよび基底チャンバーから過剰な緩衝液を慎重に吸引する。 頂端チャンバーに200 μLのCMGF+を加え、側底チャンバーに700 μLを追加します。 個々のウェルのTEER値を測定します。 プレートをインキュベーター(37°C;5%CO2 雰囲気)に24時間置きます。 該当する場合は、24時間後にTEER値を測定して、実験の品質管理部分中に単層に損傷を与える可能性を評価します。光学顕微鏡を使用して、犬のオルガノイド単層の完全性を視覚化します。 下流分析のための細胞単層の固定 ホルマリン・酢酸・アルコール溶液(FAA、 表1の組成)を調製する。 P1000ピペットまたは滅菌使い捨て9インチパスツールピペットと真空アスピレーターを使用して、頂端チャンバーおよび側底チャンバーから輸送バッファーまたはCMGF+を取り外します。 頂端室と基底室をFAAで満たします。 24時間後、FAAを吸引し、70%エタノールと交換する。 蒸発を防ぐためにプレートを柔軟な実験用フィルムで包み、準備をブロックするために進んでください。 図6:実験群全体のTEER値。 TEER値は、単層のイヌ腸管オルガノイドの5群で測定した。3つのグループは犬の空腸腸薬で構成され、2つのグループはコロノイドで構成されていました。各群は、12〜22回の反復を含む。空腸腸内膜培養物のTEER値は4日目から14日目まで、コロノイド培養物は4日目から12日目まで示されている(オルガノイド単層が定常状態の値に達した時点で測定が終了し、単層が実験的使用の準備ができたことを示す)。エラーバーは測定値のSEMを表します。略語:TEER =経上皮電気抵抗。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。