הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

שינויים לאחר התרגום (PTMs) הם מנגנון חשוב בנוגע לוויסות חלבונים, החיוני להומאוסטזיס של התא. יוביקוויטילציה של חלבונים היא שינוי דינמי ומורכב שיוצר מגוון של אותות שונים וכתוצאה מכך מספר תוצאות תאיות באורגניזמים אאוקריוטים. יוביקוויטילציה היא תהליך הפיך המורכב מהצמדת חלבון יוביקוויטין המכיל 76 חומצות אמינו למצע, המתרחש במפל אנזימטי המורכב משלוש תגובות נפרדות¹. הצעד הראשון מאופיין בהפעלת יוביקוויטין, התלויה בהידרוליזה של ATP כדי ליצור יוביקוויטין המקושר לתיואסטר באנרגיה גבוהה בין יוביקוויטין C-terminus לבין שאריות הציסטאין הנמצאות באתר הפעיל של האנזים E1. לאחר מכן, האוביקוויטין מועבר לאנזים E2 ויוצר קומפלקס דמוי תיואסטר עם יוביקוויטין. לאחר מכן, האוביקוויטין מחובר באופן קוולנטי לסובסטרט על ידי E2, או לעתים קרובות יותר, על ידי האנזים E3, שמזהה את הסובסטרט ^2,3 ומתקשר איתו. לעיתים, אנזימי E4 (גורמי התארכות שרשרת יוביקוויטין) נחוצים כדי לקדם מכלול שרשרת מולטי-יוביקוויטין³.

ליוביקוויטין יש שבעה שאריות ליזין (K6, K11, K27, K29, K33, K48 ו-K63), מה שמאפשר היווצרות של שרשראות פוליוביקוויטין שיוצרות חוליות נפרדות כדי לייצר מבנים תלת-ממדיים שונים שעומדים להיות מזוהים על ידי מספר חלבונים משפיעים ^4,5. לפיכך, סוג שרשרת הפוליוביקוויטין שהוכנסה למצע חיוני כדי להחליט על גורל התא שלו ^6,7,8. יתר על כן, המצע יכול להיות גם בכל מקום דרך שאריות N-terminal שלו הנקראות N-degrons. יוביקוויטין-ליגאזות E3 ספציפיות אחראיות לזיהוי N-degron, ומאפשרות פוליוביקוויטילציה של שאריות ליזין סמוכות⁹.

כיום, ישנם יותר מ -40 מצעים שונים ספציפיים ל- SCF המאופיינים. בין אלה, ניתן למצוא מווסתים מרכזיים של מספר מסלולים ביולוגיים, כולל התמיינות והתפתחות תאים, כמו גם הישרדות תאים ומוות, 10,11,12,13. לפיכך, זיהוי של מצעים ספציפיים של כל יוביקוויטין-ליגאז E3 חיוני לתכנון מפה מקיפה של אירועים ביולוגיים שונים. אף על פי שהזיהוי של מצעים אמיתיים הוא מאתגר מבחינה ביוכימית, השימוש בשיטות מבוססות ביוכימיה מתאים מאוד להערכת ספציפיות השרשרת וההבחנה בין מונו לפוליוביקוויטילציה¹⁴. מחקר זה מתאר פרוטוקול מלא לבדיקת יוביקוויטילציה באמצעות קו תאי היונק HEK293T המבטא יתר על המידה את המצע UXT-V2 (מבוטא בכל מקום דמוי פרפולדין דמוי מלווה איזופורם 2) עם קומפלקס E3 יוביקוויטין-ליגאז SCF(Fbxo7). UXT-V2 הוא גורם משותף חיוני לאיתות NF-κB, וברגע שחלבון זה מופל בתאים, הוא מעכב את הפעלת NF-κB המושרה על ידי TNF-α¹¹. לפיכך, כדי לזהות UXT-V2 פוליוביקוויטילציה, מעכב הפרוטאזום MG132 משמש מכיוון שיש לו את היכולת לחסום את הפעילות הפרוטאוליטית של תת-היחידה 26S של קומפלקס הפרוטאזום¹⁵. יתר על כן, תמצית התא מוגשת ל- IP בקנה מידה קטן כדי לטהר את המצע, תוך שימוש בנוגדן ספציפי המשותק לשרף אגרוז לצורך זיהוי מאוחר יותר על ידי WB באמצעות נוגדנים נבחרים. פרוטוקול זה שימושי מאוד כדי לאמת יוביקוויטילציה של מצע בסביבה התאית, וניתן גם להתאים אותו לסוגים שונים של תאי יונקים ולקומפלקסים אחרים של יוביקוויטין-ליגאז E3. עם זאת, יש צורך לאמת את המצע שנבדק באמצעות בדיקת יוביקוויטילציה במבחנה גם כן, שכן שני הפרוטוקולים משלימים זה את זה לגבי זיהוי מצעים אמיתיים.