세포 밖 소포 분석을 위한 동결-골절 전자 현미경 검사

1. 암성 비뇨생식기 세포 배양 및 EV의 분리 주: 인간 침습성 방광암 비뇨기피 (T24) 세포주로부터 EVs를 수득하기 위한 프로토콜이 제시된다. 그러나, 배양 조건은 다른 세포 유형을 사용하도록 최적화되어야 한다. 3 × 10 4 세포/cm2의 밀도를 갖는T24 세포를 3개의 플라스크 (성장 표면 75 cm2)에 플레이트하고, 세포를 37°C 및 5%CO2에서 3일 동안CO2 인큐베이터에서 배양하는 것으로 시작한다 (도 2A). 5% 태아 소 혈청(FBS), 4 mM 글루타맥스, 100 mg/mL 스트렙토마이신 및 100 U/mL 페니실린으로 보충된 A-DMEM과 F12의 1:1(v/v) 혼합물에서 T24 세포에 대한 배양 배지를 사용하십시오.참고: 다음 분리는 MV에서 강화된 EV를 산출합니다. 분리를 시작하기 전에 광학 현미경으로 세포를 검사하여 생존력과 합류성을 확인하십시오 (그림 2B). T24 세포가 70% 합류할 때 컨디셔닝 배양 배지로부터 EVs를 수집하기 시작한다. 플라스크(T75)에서 피펫이 있는 MVs를 갖는 배양 배지를 원뿔형 원심분리 튜브로 수집한다(그림 2C). 4°C에서 10분 동안 300 × g 에서 원심분리한다(도 2D). 상층액을 피펫이 있는 새로운 원심분리 튜브에 조심스럽게 모으십시오(그림 2E). 상층액을 4°C에서 20분 동안 2,000 × g에서 원심분리한다. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 수집하여 새로운 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 4°C에서 40분 동안 10,000 × g 에서 원심분리한다. 튜브 바닥에 희끄무레 한 펠릿이 있는지 확인하십시오.주: 필요한 경우 원심분리기 로터를 교체하여 필요한 g-force에 도달하십시오. EV 펠릿은 원심분리 튜브의 바닥에 백색 펠릿으로 보인다 (도 2F); 피펫팅 중에 펠릿이 손실되지 않도록 위치를 표시하십시오(그림 2G). 피펫으로 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 펠렛에 PBS 1.5 mL를 첨가하고 MV를 함유하는 펠렛을 재현탁시켰다. 현탁액을 새로운 원심분리 튜브에 넣는다. 4°C에서 40분 동안 10,000 × g 에서 원심분리하고, 튜브의 바닥에 백색 펠릿의 존재를 조사한다.참고 : EV 펠릿은 원심 분리기 튜브의 바닥에 흰색 패치로 보입니다. 피펫팅 중에 펠릿이 손실되지 않도록 위치를 표시하십시오. 피펫으로 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7.2)에 고정제, 2.5% 글루타르알데히드를 부드럽게 첨가한다. 4°C에서 20분 동안 그대로 두십시오(그림 2H).주의: 글루타르알데히드와 카코딜레이트나트륨은 독성이 있습니다. 흄 후드에서 작업하고, 보호 장갑을 착용하고, 적절하게 버리십시오. 조심스럽게 피펫으로 고정 장치를 제거하십시오. 펠렛에 세척 완충액(0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액)을 첨가한다. 펠렛을 재현탁시키지 않고 4°C에서 10분 동안 방치한다. 2. EV의 냉동 참고 : 동결하기 전에 먼저 글리세롤로 샘플을 냉동 보호하십시오. 0.1 M 소듐 카코딜레이트 버퍼를 준비한다. 세척 완충액을 제거하고 0.1 M 카코딜레이트 완충액에 30% 글리세롤 50 μL를 첨가한다. EV를 부드럽게 재현탁하여 용액을 균질하게 만듭니다. 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 클로로포름으로 초음파 욕조의 중앙 구덩이로 구리 캐리어를 5 분 동안 청소하십시오 (그림 3A). 공기 건조시키고 여러 샘플을 사용하는 경우 색상으로 표시하십시오 (그림 3B). 사용할 때까지 캐리어를 건조하고 깨끗한 장소(예: 페트리 접시의 렌즈 용지)에 보관하십시오. 맨손으로 캐리어를 만지지 마십시오. 피펫, 용액, 여과지, 핀셋, 입체 현미경, 프레온 및 액체 질소 (LN2)가있는 Dewar 플라스크, 금속 막대 및 냉동 장치를 준비하십시오. LN2로 식히십시오.주의: LN2 및 냉각 프레온을 취급할 때 보호 장비를 착용하고 그에 따라 작업하십시오. 정지하기 전에 EV를 다시 일시 중단하십시오. 기포의 형성을 피하십시오.참고: 2.4-2.7단계를 빠르게 수행하십시오. 입체 현미경으로 작업하십시오 (그림 3C). 1.5-1.7μL의 샘플을 구리 캐리어의 중앙 구덩이로 옮겨 샘플을 가장자리 위로 쏟아내지 않으면서 구리 캐리어 에지보다 높은 볼록한 드롭을 만듭니다(그림 3D). 과다 유출의 경우 여과지를 사용하여 캐리어의 외부 링을 건조시킵니다. 응고된 프레온을 금속 막대와 혼합하여 다시 액화시킵니다(그림 3E). 핀셋으로 구리 캐리어의 외부 링을 잡고 핀셋을 부드럽게 흔들면서 냉각 프레온에 8초 동안 담그십시오(그림 3F). 8초 후, 캐리어를LN2로 채워진 다른 Dewar 플라스크로 신속하게 옮깁니다. 파쇄를 즉시 진행하거나 샘플을LN2에 저장한다. 후자의 경우, 냉동 장치를 표시하고 바이알과 핀셋 팁을 LN2 에 담그면 식힙니다(그림 3G). LN2 아래에서 냉동 구리 운반선을 바이알에 모아 닫은 다음 동결 파쇄될 때까지 LN2 용기(그림 3H)에 보관합니다. 3. EV의 파쇄 및 복제본 만들기 주: 제조업체의 작동 지침에 따라 동결 파쇄 장치를 준비하십시오. (도 4A). 장치의 챔버를 청소하십시오. 백금(Pt/C)과 탄소(C) 총을 각각 45° 및 90°의 각도로 배치합니다(그림 4B). 단위 진공 시스템을 시작합니다. 6.6 × 10-2 Pa (5 × 10-4 Torr)의 압력에 도달하면 장치 챔버를 -150 °C로 냉각하십시오. 냉동 샘플이 있는 구리 캐리어를 건조 핀셋을 사용하여 동결 파쇄 장치로 옮깁니다(그림 4C). 냉동 이송을 사용하거나 샘플을 해동하고 얼음 결정이 증착되는 것을 피하기 위해 빠르게 작업하십시오. 캐리어를 샘플 테이블에 고정합니다. 진공이 다시 6.6 × 10-2 Pa (5 × 10-4 Torr)에 도달 할 때까지 기다린 다음 나이프 온도를 -100 °C로 설정하십시오 (그림 4D). 진공이 1.0 × 10-3 Pa (8 × 10-6 Torr)에 도달 할 때까지 기다리십시오. 쌍안경으로 샘플을 관찰하고 조심스럽게 칼에 접근하십시오 (그림 4E). 나이프의 전동 이동(그림 4F)을 켜서 샘플을 단면화하고 샘플 표면이 매끄럽게 될 때까지 단면화합니다(그림 4G). 파쇄를 위해 나이프의 전동 운동을 끄고 나이프의 느린 수동 제어를 진행하여 샘플을 파쇄합니다 (그림 4H). 파괴 된 표면이 그림자가 될 때까지 얼음 결정과 파편을 형성하지 않도록 보호하려면 칼을 골절 된 샘플 위로 옮깁니다. Pt 섀도잉을 45°에서 진행합니다(그림 4I, J). 스톱워치를 준비하거나 동결 파쇄 장치에서 석영 크리스탈 모니터를 켜면 샘플의 Pt의 두께를 감독 할 수 있습니다. 석영 크리스털 모니터에서 측정된 Pt 층의 권장 두께는 2.5nm이며, 이는 주어진 높은 장력 및 전류에서 4초의 섀도잉에 해당합니다(즉, Pt 섀도잉의 속도는 0.63nm/s임). 섀도잉을 시작하기 전에 칼을 샘플에서 멀리 옮깁니다. Pt/C 주포(1,600V)에 높은 장력을 적용하고 전류를 60mA로 증가시킵니다. Pt의 스파크가 나타나야 하며 샘플의 그림자가 나타나기 시작해야 합니다. 이 시점에서 4초 카운트다운을 시작하고 석영 크리스탈 모니터에서 Pt의 위치를 관찰하고 찾습니다.참고: C 층의 권장 두께는 2.5nm이며, 이는 주어진 높은 장력과 전류에서 10초의 그림자에 해당합니다. 원하는 Pt의 두께를 얻을 때 전류와 높은 장력을 끄십시오. 90°에서 C 섀도잉을 진행합니다(즉, C 섀도잉의 속도는 0.25nm/s임). C 건 (1,900 V)에 높은 장력을 적용하고 전류를 90mA로 늘리면 C의 스파크가 나타나고 샘플이 그림자를 드리우기 시작해야합니다. 그 순간 10 초 카운트 다운을 시작하십시오. 원하는 두께의 C가 얻어지면 전류와 높은 장력을 끄십시오. 4. 복제본 및 복제본 분석 정리 샘플 테이블의 구리 캐리어를 사용하여 핀셋으로 도자기 12웰 플레이트의 실온에서 증류수로 옮깁니다(그림 4K). 복제본은 물 표면에 떠 있고 캐리어는 가라앉습니다(그림 4L). 와이어 루프가있는 복제본을 증류수에서 차아 염소산 나트륨이있는 우물로 옮깁니다. 뚜껑을 덮고 실온에서 밤새 흄 후드에 두십시오.주의: 차아염소산나트륨은 독성이 있습니다. 흄 후드에서 작업하고, 보호 장갑을 착용하고, 적절하게 버리십시오. 복제본을ddH2O로 옮기고 30분 동안 세척한다. 3 번 반복하십시오. 와이어 루프가 있는 복제본을 메쉬 구리 TEM 그리드(예: 정사각형 또는 벌집 100+ 메쉬)로 전송합니다. 그리드를 2 시간 동안 공기 건조시킨 다음 현미경 검사가있을 때까지 그리드 저장 상자에 보관하십시오.참고: 일반적으로 그리드는 어둡고 건조한 실내 온도 조건에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. TEM 현미경을 사용하여 복제본을 이미지화하고 현미경 사진을 얻습니다. 이렇게 하려면 복제본이 있는 TEM 그리드를 삽입하고 제조업체의 사용 설명서에 따라 TEM 이미징을 시작합니다. 80kV 또는 100kV에서 작업합니다. 샘플을 검사하고 TEM의 카메라로 더 낮은 배율과 높은 배율로 현미경 사진을 얻습니다. MV의 현미경 사진을 분석합니다. MV 직경을 측정하려면 피지/ImageJ 소프트웨어(16)를 사용하십시오. MV의 직경은 Hallett et al.17에 따르면 현미경 사진에서 측정 한 값의 4/π 배입니다.