CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu
Summary
Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2’ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2’leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.
Abstract
Yıllar içinde yayınlanan grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2’ler) üzerine yapılan çok sayıda araştırma ile ILC2’lerin, anti-helmint bağışıklığı, doku onarımı, termogenez ve astım ve alerjik rinit (AR) gibi otoimmün hastalıklar dahil olmak üzere çeşitli patolojik süreçlerin düzenlenmesinde rol oynadığı yaygın olarak bilinmektedir. ILC2’ler cilt, bağırsak, akciğerler ve burun boşluğu gibi periferik dokularda kalıcı olarak bulunur; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki kesin işlevleri hakkında sınırlı bilgi vardır. CD226, esas olarak doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilen aktive edici bir kostimülatör moleküldür. Bununla birlikte, ILC2’lerin CD226’yı eksprese edip etmediği veya ILC2’lerle ilişkili hastalıkların patogenezinde rol oynayıp oynamadığı bilinmemektedir. Burada, ILC2’leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir yöntem oluşturduk ve sağlıklı ve AR farelerden elde edilen ILC2’lerde CD226 ekspresyonunu tespit ettik. Burada, ILC2’lerin fare burun mukozasından izole edilmesi ve tanımlanması için bu protokolü açıklıyoruz, bu da burun mukozası hastalıklarında immünolojik bozuklukların iç patolojik mekanizmasını keşfetmeye yardımcı olacaktır.
Introduction
Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2’ler) ilk olarak farelerin periton boşluğu dokularında keşfedildi ve daha sonra kanda ve akciğerler, deri ve burun boşluğu gibi diğer periferik dokularda mevcut olduğu gösterildi 1,2,3. Dokuda yerleşik hücreler olarak, ILC2’ler esas olarak lokal olarak korunur ve çoğalır ve çok sayıda tip 2 sitokin üreterek ve tip 2 bağışıklığı indükleyerek eksojen zararlı uyaranlara cevap veren ilk muhafızlar olarak işlev görür 4,5,6. ILC2’ler ayrıca enfekte dokulara doğru kaçakçılık yaparak da etkilerini gösterebilirler 7,8.
T-helper 2 (Th2) hücrelerine benzer şekilde, ILC2’lerin karmaşık düzenleyici ağları, hava yolu alerjik hastalıkları 8,9 da dahil olmak üzere çeşitli tip 2 enflamatuar hastalıkların ilerlemesine önemli ölçüde dahil olmalarını sağlar. Astımda, epitel hücresi kaynaklı alarminler, interlökin (IL)-4, IL-5 ve IL-1310 sekresyonu yoluyla pulmoner inflamasyonu daha da teşvik eden ILC2’leri aktive edebilir. Klinik çalışmalar ayrıca, ILC2 düzeylerinin şiddetli astımlı hastaların balgamında ve kanında anlamlı derecede yükseldiğini göstermiştir, bu da ILC2’lerin astım şiddeti ile ilişkisini ve astım progresyonunun bir göstergesi olarak işlevlerini düşündürmektedir11.
Allerjik rinit (AR), her yıl milyonlarca insanı etkileyen yaygın bir kronik inflamatuar hastalıktır ve bu hastalık için etkili tedavilersınırlıdır 12,13. ILC2’ler AR’nin patofizyolojisinde, sensitizasyon fazında veya semptom oluşturma ve inflamasyon fazı14’te önemli roller oynamaktadır. AR’li hastalarda, periferik kandaki ILC2 düzeylerinin hem lokal hem de sistemik olarak yükseldiği bildirilmiştir15. Bununla birlikte, ILC2’lerin AR’nin patofizyolojisi ve progresyonu üzerindeki bazı etkileri ve altta yatan mekanizmaları hala daha fazla araştırma gerektirmektedir.
CD226 – kostimulatör bir molekül olarak işlev gören bir transmembran glikoprotein – öncelikle doğal öldürücü (NK) hücreler, T hücreleri ve diğer enflamatuar monositler üzerinde eksprese edilir16,17. CD226 ve ligandlarının (CD155 ve / veya CD112) veya rakibinin (TIGIT) etkileşimi, çeşitli bağışıklık hücrelerinin biyolojik işlevlerine katılmasına izin verir18. Antijen sunan hücrelerdeki ligandların sitotoksik lenfosit (CTL) üzerindeki CD226’ya bağlanması, her iki hücrenin aynı anda aktivasyonunu teşvik ederken, CTL’nin aktivasyonu, CD226 19,20’nin rakibi olan TIGIT (Ig ve ITIM alanlarına sahip T hücresi immünoreseptörü) tarafından daha da baskılanabilir. Bir insan ex vivo çalışması, T hücreleri üzerindeki CD226 ve CD155’in, Th alt kümeleri 21’i farklı şekilde modüle ederekTh1 / Th17 ve Th2 arasındaki dengeyi düzenlediğini ortaya koymuştur. CD226 da trombosit yapışmasına ve NK tümör öldürme aktivitesinearacılık edebilir 22,23. Bu arada, CD226 çeşitli enfeksiyon hastalıklarının, otoimmün hastalıkların ve tümörlerin patogenezinde iyi çalışılmıştır 18,24,25. Şu anda, CD226 immünoterapi için yeni bir parlak nokta haline gelmiştir. Çalışmalar, hücre dışı veziküllerin, sitotoksik aktivitelerini eski haline getirmek ve akciğer kanserinin ilerlemesine müdahale etmek için NK hücreleri üzerindeki CD226 ekspresyonunu tersine çevirebileceğini bulmuştur26. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, CD226’nın doğuştan gelen lenfoid hücre aracılı bağışıklıkta rol oynayabileceğini gösteren tek hücreli RNA dizilimi27 ile yüksek CD226 ekspresyonu ile karakterize fetal bağırsak grubu 3 ILC’lerin bir alt kümesini ortaya koymuştur.
Hava yolu inflamasyonunda ILC2’ler hakkındaki bilgilerimiz öncelikle astım üzerine yapılan çalışmalara dayanmaktadır; Bununla birlikte, burun mukozal bağışıklığındaki işlevleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Böylece, ILC2’leri burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak için bir protokol oluşturulmuştur. Çalışma, CD226’nın burun dokularındaki ILC2’ler üzerindeki ekspresyonuna ve sağlıklı ve AR fareler arasındaki varyasyonuna odaklanmaktadır. Bu, yerel bağışıklıkta ILC2 aracılı düzenlemenin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlayabilir ve AR tedavisi için yeni yaklaşımlar geliştirmek için bir temel oluşturabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ILC2’ler, artan sayıda çalışmanın gösterdiği gibi, tip 2 inflamasyon ve inflamatuar bozukluklarla yakından ilişkilidir. Hem fare modelleri hem de insan gözlemi, üst solunum yolundaki işlevinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunur. Astım patofizyolojisinde, ILC2’ler çoğunlukla epitel hücreleri tarafından üretilen timik stromal lenfopoietin, IL-25 ve IL-33 yoluyla aktive edilir. Daha sonra Th2 hücrelerini yansıtan ILC2’ler, tip 2 inflamasyonu şiddetlendirmek için IL-4, IL-5 ve IL-13 üretir<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.Z., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81871258) ve Dördüncü Askeri Tıp Üniversitesi (No.2020rcfczr) tarafından sağlanan fonlar tarafından desteklenmiştir. Y.Z., Shaanxi’nin Doğa Bilimleri Temel Araştırma Programı (No. 2021JM-081) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Aluminum hydroxide | Meilun biological Technology | 21645-51-2 | |
| CD11b | eBioscience | 11-0112-82 | Used in antibody coctail |
| CD11c | BioLegend | 117306 | Used in antibody coctail |
| CD16/32 | BioLegend | 101302 | Clone: 93; Dilution 1:100 |
| CD226 | BioLegend | 128812 | Used in antibody coctail |
| CD3e | BioLegend | 100306 | Used in antibody coctail |
| CD45 | BioLegend | 103128 | Used in antibody coctail |
| CD45R | eBioscience | 11-0452-82 | Used in antibody coctail |
| CD90.2 | BD Pharmingen | 553014 | Used in antibody coctail |
| Collagenase IV | DIYIBio | DY40128 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | absolute counting beads |
Dnase  |
Beyotime | D7076 | |
| Fetal Bovine Serum | gibco | 10270-106 | |
| Fixable Viability Dye eFluor 520 (FITC) | eBioscience | 65-0867-14 | FVD |
| HBSS, calcium, magnesium | Servicebio | G4204-500 | |
| KLRG1 | eBioscience | 17-5893-81 | Used in antibody coctail |
| NaN3 | SIGMA | S2002 | |
| NovoExpress software | AgilentTechnologies | Version 1.5.0 | flow cytometry (FCM) analysis software |
| OVA | SIGMA | 9006-59-1 | |
| PBS, 1x | Servicebio | G4202-500 | |
| PBS, 10x | Servicebio | G4207-500 | |
| Percoll | Yeasen | 40501ES60 | density gradient media |
| RPMI 1640 culture media | Corning | 10-040-CVRV | |
| Spectral cell analyzer | SONY | SA3800 |
References
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Price, A. E., et al. Systemically dispersed innate IL-13-expressing cells in type 2 immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11489-11494 (2010).
- Ebihara, T., et al. Trained innate lymphoid cells in allergic diseases. Allergology International. 70 (2), 174-180 (2021).
- Gasteiger, G., Fan, X., Dikiy, S., Lee, S. Y., Rudensky, A. Y. Tissue residency of innate lymphoid cells in lymphoid and nonlymphoid organs. Science. 350 (6263), 981-985 (2015).
- Moro, K., et al. Interferon and IL-27 antagonize the function of group 2 innate lymphoid cells and type 2 innate immune responses. Nature Immunology. 17 (1), 76-86 (2016).
- Helou, D. G., et al. LAIR-1 acts as an immune checkpoint on activated ILC2s and regulates the induction of airway hyperreactivity. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 149 (1), 223-236 (2022).
- Karta, M. R., et al. beta2 integrins rather than beta1 integrins mediate Alternaria-induced group 2 innate lymphoid cell trafficking to the lung. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 329-338 (2018).
- Helou, D. G., et al. PD-1 pathway regulates ILC2 metabolism and PD-1 agonist treatment ameliorates airway hyperreactivity. Nature Communications. 11 (1), 3998 (2020).
- Kabata, H., Moro, K., Koyasu, S. The group 2 innate lymphoid cell (ILC2) regulatory network and its underlying mechanisms. Immunological Reviews. 286 (1), 37-52 (2018).
- Zheng, H., et al. The role of Type 2 innate lymphoid cells in allergic diseases. Frontiers in Immunology. 12, 586078 (2021).
- Maggi, L., et al. The dual function of ILC2: From host protection to pathogenic players in type 2 asthma. Molecular Aspects of Medicine. 80, 100981 (2021).
- Meltzer, E. O., et al. Burden of allergic rhinitis: results from the Pediatric Allergies in America survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 124, 43-70 (2009).
- Wheatley, L. M., Togias, A. Clinical practice. Allergic rhinitis. The New England Journal of Medicine. 372 (5), 456-463 (2015).
- Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 95 (2020).
- Kato, A. Group 2 innate lymphoid cells in airway diseases. Chest. 156 (1), 141-149 (2019).
- Nakamura-Shinya, Y., et al. DNAM-1 promotes inflammation-driven tumor development via enhancing IFN-gamma production. International Immunology. 34 (3), 149-157 (2022).
- Braun, M., et al. CD155 on Tumor cells drives resistance to immunotherapy by inducing the degradation of the activating receptor CD226 in CD8(+) T cells. Immunity. 53 (4), 805-823 (2020).
- Huang, Z., Qi, G., Miller, J. S., Zheng, S. G. CD226: An emerging role in immunologic diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 564 (2020).
- Gilfillan, S., et al. DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors. Journal of Experimental Medicine. 205 (13), 2965-2973 (2008).
- Zhang, D., et al. TIGIT-Fc alleviates acute graft-versus-host disease by suppressing CTL activation via promoting the generation of immunoregulatory dendritic cells. Biochimica et Biophysica Acta: Molecular Basis of Disease. 1864, 3085-3098 (2018).
- Lozano, E., Joller, N., Cao, Y., Kuchroo, V. K., Hafler, D. A. The CD226/CD155 interaction regulates the proinflammatory (Th1/Th17)/anti-inflammatory (Th2) balance in humans. Journal of Immunology. 191 (7), 3673-3680 (2013).
- Kojima, H., et al. CD226 mediates platelet and megakaryocytic cell adhesion to vascular endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278 (38), 36748-36753 (2003).
- Martinet, L., Smyth, M. J. Balancing natural killer cell activation through paired receptors. Nature Reviews. Immunology. 15 (4), 243-254 (2015).
- Yeo, J., Ko, M., Lee, D. H., Park, Y., Jin, H. S. TIGIT/CD226 axis regulates anti-tumor immunity. Pharmaceuticals. 14 (3), 200 (2021).
- Nakano, M., et al. Association of elevated serum soluble CD226 levels with the disease activity and flares of systemic lupus erythematosus. Scientific Reports. 11 (1), 16162 (2021).
- Chang, W. A., et al. miR-150-5p-containing extracellular vesicles are a new immunoregulator that favor the progression of lung cancer in hypoxic microenvironments by altering the phenotype of NK cells. Cancers. 13 (24), 6552 (2021).
- Stehle, C., et al. T-bet and RORalpha control lymph node formation by regulating embryonic innate lymphoid cell differentiation. Nature Immunology. 22 (10), 1231-1244 (2021).
- Piao, C. H., Fan, Y. J., Nguyen, T. V., Song, C. H., Chai, O. H. Mangiferin alleviates ovalbumin-induced allergic rhinitis via Nrf2/HO-1/NF-kappaB signaling pathways. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3415 (2020).
- Zhao, Y., Tao, Q., Wu, J., Liu, H. DMBT1 has a protective effect on allergic rhinitis. Biomedicine and Pharmacotherapy. 121, 109675 (2020).
- Piao, C. H., et al. Ethanol extract of Dryopteris crassirhizoma alleviates allergic inflammation via inhibition of Th2 response and mast cell activation in a murine model of allergic rhinitis. Journal of Ethnopharmacology. 232, 21-29 (2019).
- Liang, M. J., et al. Immune responses to different patterns of exposure to ovalbumin in a mouse model of allergic rhinitis. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 273 (11), 3783-3788 (2016).
- Ebbo, M., Crinier, A., Vely, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews. Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
- Seehus, C. R., et al. Alternative activation generates IL-10 producing type 2 innate lymphoid cells. Nature Communications. 8 (1), 1900 (2017).
- Cai, T., et al. IL-17-producing ST2(+) group 2 innate lymphoid cells play a pathogenic role in lung inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (1), 229-244 (2019).
- Golebski, K., et al. IL-1beta, IL-23, and TGF-beta drive plasticity of human ILC2s towards IL-17-producing ILCs in nasal inflammation. Nature Communications. 10 (1), 2162 (2019).
- Lei, A., Zhou, J. Cell-surface molecule-mediated cell-cell interactions in the regulation of ILC2-driven allergic inflammation. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (22), 4503-4510 (2019).
- Maazi, H., et al. ICOS:ICOS-ligand interaction is required for type 2 innate lymphoid cell function, homeostasis, and induction of airway hyperreactivity. Immunity. 42 (3), 538-551 (2015).
- Lei, A. H., et al. ICAM-1 controls development and function of ILC2. The Journal of Experimental Medicine. 215 (8), 2157-2174 (2018).
- Drake, L. Y., Iijima, K., Kita, H. Group 2 innate lymphoid cells and CD4+ T cells cooperate to mediate type 2 immune response in mice. Allergy. 69 (10), 1300-1307 (2014).
- Wang, Y., et al. The comparation of intraperitoneal injection and nasal-only delivery allergic rhinitis model challenged with different allergen concentration. American Journal of Rhinology & Allergy. 33 (2), 145-152 (2019).
- Niu, Y., et al. HIF1alpha deficiency in dendritic cells attenuates symptoms and inflammatory indicators of allergic rhinitis in a SIRT1-dependent manner. International Archives of Allergy and Immunology. 181 (8), 585-593 (2020).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of alpha-lipoic acid via balancing Th17/Treg expression and enhancing Nrf2/HO-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Pyun, B. J., et al. Gardenia jasminoides attenuates allergic rhinitis-induced inflammation by inhibiting periostin production. Pharmaceuticals (Basel). 14 (10), 986 (2021).
- Liu, Z., et al. Analysis of expression of ILC2 cells in nasal mucosa based on animal model of allergic bacterial infection rhinitis. Journal of Infection and Public Health. 14 (1), 77-83 (2021).
- Hu, B., Wang, Y., Zheng, G., Zhang, H., Ni, L. Effect of parasympathetic inhibition on expression of ILC2 cells in a mouse model of allergic rhinitis. The World Allergy Organization journal. 14 (9), 100582 (2021).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Krisna, S. S., et al. Optimized protocol for immunophenotyping of melanoma and tumor-bearing skin from mouse. STAR Protocols. 2 (3), 100627 (2021).
- Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Loering, S., et al. Differences in pulmonary group 2 innate lymphoid cells are dependent on mouse age, sex and strain. Immunology and Cell Biology. 99 (5), 542-551 (2021).
- Lin, L., et al. Allergic inflammation is exacerbated by allergen-induced type 2 innate lymphoid cells in a murine model of allergic rhinitis. Rhinology Journal. 55 (4), 339-347 (2017).
