Déchiffrer le mécanisme moléculaire de l’assemblage des histones par la technique du rideau d’ADN

L’ADN eucaryote est emballé dans une structure d’ordre supérieur connue sous le nom de chromatine ^1,2. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine, qui se compose d’environ 147 pb d’ADN enroulé autour des histones octamères ^3,4. La chromatine joue un rôle essentiel dans les cellules eucaryotes ; par exemple, la structure compacte protège l’ADN des facteurs endogènes et des menaces exogènes⁵. La structure de la chromatine change dynamiquement en fonction de la phase du cycle cellulaire et des stimuli environnementaux, et ces changements contrôlent l’accès aux protéines lors des transactions de l’ADN telles que la réplication, la transcription et la réparation⁶. La dynamique de la chromatine est également importante pour la stabilité génomique et l’information épigénétique.

La chromatine est régulée dynamiquement par divers facteurs, y compris les modifications de la queue des histones et les organisateurs de la chromatine tels que les remodeleurs de chromatine, les protéines du groupe polycomb et les chaperons d’histones⁷. Les chaperons histones coordonnent l’assemblage et le désassemblage des nucléosomes par dépôt ou détachement des histones centrales ^8,9. Les défauts dans les chaperons d’histones induisent une instabilité du génome et provoquent des troubles du développement et des cancers ^9,10. Divers chaperons d’histones n’ont pas besoin de consommation d’énergie chimique comme l’hydrolyse de l’ATP pour assembler ou désassembler les nucléosomes 9,11,12,13. Récemment, des chercheurs ont rapporté que les ATPases AAA+ (ATPase associées à diverses activités cellulaires) contenant des bromodomaines jouent un rôle dans la dynamique de la chromatine en tant que chaperons d’histones 14,15,16,17. L’ATAD2 humain (protéine 2 contenant le domaine AAA de la famille des ATPase) favorise l’accessibilité de la chromatine pour améliorer l’expression des gènes¹⁸. En tant que co-régulateur transcriptionnel, l’ATAD2 régule la chromatine des facteurs transcriptionnels oncogènes¹⁴, et la surexpression d’ATAD2 est liée à un mauvais pronostic dans de nombreux types de cancer¹⁹. Yta7, l’homologue de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) d’ATAD2, diminue la densité des nucléosomes dans la chromatine¹⁵. En revanche, Abo1, l’homologue Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) d’ATAD2, augmente la densité des nucléosomes¹⁶. À l’aide d’une technique unique d’imagerie à molécule unique, le rideau d’ADN, la question de savoir si Abo1 contribue à l’assemblage ou au désassemblage des nucléosomes est abordée^17,20.

Traditionnellement, les propriétés biochimiques des biomolécules ont été examinées par des expériences en masse telles que le test de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA) ou la co-immunoprécipitation (co-IP), dans lesquelles un grand nombre de molécules sont sondées, et leurs propriétés moyennes sont caractérisées^21,22. Dans les expériences en vrac, les sous-états moléculaires sont voilés par l’effet d’ensemble-moyenne, et l’exploration des interactions biomoléculaires est limitée. En revanche, les techniques à molécule unique contournent les limites des expériences en vrac et permettent la caractérisation détaillée des interactions biomoléculaires. En particulier, les techniques d’imagerie à molécule unique ont été largement utilisées pour étudier les interactions ADN-protéine et protéine-protéine²³. L’une de ces techniques est le rideau d’ADN, une technique unique d’imagerie à molécule unique basée sur la microfluidique et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRFM)^24,25. Dans un rideau d’ADN, des centaines de molécules d’ADN individuelles sont ancrées à la bicouche lipidique, ce qui permet le mouvement bidimensionnel des molécules d’ADN en raison de la fluidité lipidique. Lorsque l’écoulement hydrodynamique est appliqué, les molécules d’ADN se déplacent le long de l’écoulement sur la bicouche et restent coincées à une barrière de diffusion, où elles sont alignées et étirées. Alors que l’ADN est coloré avec des agents intercalants, des protéines marquées par fluorescence sont injectées, et TIRFM est utilisé pour visualiser les interactions protéine-ADN en temps réel au niveau d’une seule molécule²³. La plate-forme de rideau d’ADN facilite l’observation des mouvements des protéines tels que la diffusion, la translocation et la collision 26,27,28. De plus, le rideau d’ADN peut être utilisé pour la cartographie des protéines sur l’ADN avec des positions, des orientations et des topologies définies ou appliqué à l’étude de la séparation de phase des protéines et des acides nucléiques 29,30,31.

Dans ce travail, la technique du rideau d’ADN est utilisée pour fournir des preuves de la fonction des chaperons grâce à la visualisation directe de protéines spécifiques. De plus, comme DNA curtain est une plate-forme à haut débit, elle facilite une collecte de données suffisante pour assurer la fiabilité statistique. Ici, il est décrit comment effectuer le test de rideau d’ADN en détail pour étudier le rôle moléculaire de l’AAA+ ATPase Abo1 contenant du bromodomaine de S. pombe .