DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.
Chromatine is een structuur van hogere orde die eukaryotisch DNA verpakt. Chromatine ondergaat dynamische veranderingen afhankelijk van de fase van de celcyclus en als reactie op prikkels uit de omgeving. Deze veranderingen zijn essentieel voor genomische integriteit, epigenetische regulatie en DNA-metabole reacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie. Chromatine-assemblage is cruciaal voor de chromatinedynamiek en wordt gekatalyseerd door histon-chaperonnes. Ondanks uitgebreide studies blijven de mechanismen waarmee histon-chaperonnes chromatine-assemblage mogelijk maken, ongrijpbaar. Bovendien worden de globale kenmerken van nucleosomen georganiseerd door histon-chaperonnes slecht begrepen. Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit werk een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn genaamd, die het onderzoek van de moleculaire details van nucleosoomassemblage door histon-chaperonnes vergemakkelijkt. DNA-gordijn is een hybride techniek die lipidevloeibaarheid, microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) combineert om een universeel platform te bieden voor real-time beeldvorming van diverse eiwit-DNA-interacties. Met behulp van DNA-gordijn wordt de histon-chaperonnefunctie van Abo1, het Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattende AAA+ ATPase, onderzocht en wordt het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan histonassemblage van Abo1 onthuld. DNA-gordijn biedt een unieke benadering voor het bestuderen van chromatinedynamiek.
Eukaryotisch DNA is verpakt in een structuur van hogere orde die bekend staat als chromatine 1,2. Nucleosoom is de fundamentele eenheid van chromatine, die bestaat uit ongeveer 147 bp DNA gewikkeld rond de octamere kernhistonen 3,4. Chromatine speelt een cruciale rol in eukaryote cellen; de compacte structuur beschermt bijvoorbeeld DNA tegen endogene factoren en exogene bedreigingen5. De chromatinestructuur verandert dynamisch afhankelijk van de fase van de celcyclus en omgevingsstimuli, en deze veranderingen regelen de toegang tot eiwitten tijdens DNA-transacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie6. Chromatinedynamiek is ook belangrijk voor genomische stabiliteit en epigenetische informatie.
Chromatine wordt dynamisch gereguleerd door verschillende factoren, waaronder histonstaartmodificaties en chromatine-organisatoren zoals chromatine-remodelers, polycomb-groepeiwitten en histon-chaperonnes7. Histon-chaperonnes coördineren de assemblage en demontage van nucleosomen via afzetting of onthechting van kernhistonen 8,9. Defecten in histon-chaperonnes veroorzaken genoominstabiliteit en veroorzaken ontwikkelingsstoornissen en kanker 9,10. Verschillende histonchaperonnes hebben geen chemisch energieverbruik zoals ATP-hydrolyse nodig om nucleosomen te assembleren of te demonteren 9,11,12,13. Onlangs meldden onderzoekers dat broomdomein-bevattende AAA+ (ATPase geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten) ATPases een rol spelen in de chromatinedynamiek als histonchaperonnes 14,15,16,17. Humaan ATAD2 (ATPase-familie AAA-domeinbevattend eiwit 2) bevordert de toegankelijkheid van chromatine om de genexpressie te verbeteren18. Als transcriptionele co-regulator reguleert ATAD2 het chromatine van oncogene transcriptionele factoren14, en de overexpressie van ATAD2 is gerelateerd aan een slechte prognose bij veel soorten kanker19. Yta7, de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloog van ATAD2, verlaagt de nucleosoomdichtheid in chromatine15. Abo1 daarentegen, de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloog van ATAD2, verhoogt de nucleosoomdichtheid16. Met behulp van een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn, wordt nagegaan of Abo1 bijdraagt aan nucleosoomassemblage of -demontage17,20.
Traditioneel worden de biochemische eigenschappen van biomoleculen onderzocht door middel van bulkexperimenten zoals de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) of co-immunoprecipitatie (co-IP), waarbij een groot aantal moleculen wordt onderzocht en hun gemiddelde eigenschappen worden gekarakteriseerd21,22. In bulkexperimenten worden moleculaire subtoestanden versluierd door het ensemble-gemiddelde effect en zijn het onderzoeken van biomoleculaire interacties beperkt. Daarentegen omzeilen technieken met één molecuul de beperkingen van bulkexperimenten en maken ze de gedetailleerde karakterisering van biomoleculaire interacties mogelijk. In het bijzonder zijn beeldvormingstechnieken met één molecuul op grote schaal gebruikt om DNA-eiwit en eiwit-eiwitinteracties te bestuderen23. Een van die technieken is DNA-gordijn, een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul op basis van microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM)24,25. In een DNA-gordijn zijn honderden individuele DNA-moleculen verankerd aan de lipidedubbellaag, die de tweedimensionale beweging van DNA-moleculen mogelijk maakt als gevolg van lipidevloeibaarheid. Wanneer hydrodynamische stroming wordt toegepast, bewegen DNA-moleculen langs de stroom op de dubbellaag en komen vast te zitten bij een diffusiebarrière, waar ze worden uitgelijnd en uitgerekt. Terwijl DNA wordt gekleurd met intercalerende middelen, worden fluorescerend gelabelde eiwitten geïnjecteerd en wordt TIRFM gebruikt om eiwit-DNA-interacties in realtime te visualiseren op een niveau van één molecuul23. Het DNA-gordijnplatform vergemakkelijkt de observatie van eiwitbewegingen zoals diffusie, translocatie en botsing 26,27,28. Bovendien kan DNA-gordijn worden gebruikt voor het in kaart brengen van eiwitten op DNA met gedefinieerde posities, oriëntaties en topologieën of worden toegepast op de studie van fasescheiding van eiwitten en nucleïnezuren 29,30,31.
In dit werk wordt de DNA-gordijntechniek gebruikt om bewijs te leveren voor de functie van chaperonnes door middel van directe visualisatie van specifieke eiwitten. Omdat DNA-gordijn een high-throughput-platform is, vergemakkelijkt het bovendien een mate van gegevensverzameling die voldoende is voor statistische betrouwbaarheid. Hier wordt beschreven hoe de DNA-gordijntest in detail kan worden uitgevoerd om de moleculaire rol van S. pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase Abo1 te onderzoeken.
Als beeldvormingstechniek met één molecuul is DNA-gordijn op grote schaal gebruikt om DNA-metabolische reacties te onderzoeken43. DNA-gordijn is een hybride systeem dat lipidevloeibaarheid, microfluïdica en TIRFM samenvoegt. In tegenstelling tot andere technieken met één molecuul, maakt DNA-gordijn real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met hoge doorvoer mogelijk. Daarom is de DNA-gordijntechniek geschikt voor het onderzoeken van het mechanisme achter moleculaire interacties, waaron…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs waarderen de vriendelijke steun voor Abo1 en Cy5-H3-H4 door professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., en Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Zuid-Korea. Dit werk wordt ondersteund door de National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), het intramurale onderzoeksfonds (1.210115.01) van het Ulsan National Institute of Science and Technology en het Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).
1 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 301321 | |
1' x 3' fused-silca slide glass | G. Finkenbeiner | 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness | |
10 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302149 | |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti | 850375 | This is a component of biotinylated lipid stock |
18:1 Biotinyl cap PE | Avanti | 870273 | This is a component of biotinylated lipid stock |
18:1 PEG2000 PE | Avanti | 880130 | This is a component of biotinylated lipid stock |
3 mL luer-lock syringe | BecktonDickinson | 302832 | |
6-way sample injection valve | IDEX | MX series II | |
950K PMMA | All-resist | 671.04 | |
Acetone | SAMCHUN | A1759 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | |
Aluminum (Al) | TASCO, South Korea | LT50AI414 | Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch |
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa | Millipore | Z648027 | |
Ampicillin | Mbcell | MB-A4128 | Antibiotics |
AZ 300 MIF developer | Merck | 10454110521 | Used for removing aluminum |
Blade | DORCO | DN52 | 12 mm x 6 m |
Boron trichloride (BCl3) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
Catalase | Sigma | C40-1g | This is a component of 100x gloxy stock |
Chlorine (Cl2) | UNIONGAS | Purity: >99.99% | |
Clear double-sided tape | 3M | 313770 | |
D-(+)-glucose | Sigma | G7528 | |
DC sputter | Sorona | SRM-120 | Used for deposition aluminum on a slide |
Diamond-coated drill bit | Eurotool | DIB-211.00 | Used for making holes in a fusced silica slide |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
Dove-prism | Korea Electro-Optics Co. Ltd. | 1906-106 | Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating |
Drill | Dremel | Dremel 3000 | Used for making holes in a fusced silica slide |
Electron Bean Lithography | Nanobeam Ltd. | NB3 | |
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-1KG | |
Fingertight fittings | IDEX | F-300 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
Flangeless male nut | IDEX | P-235 | It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing |
Freeze Dryer, HyperCOOL | Labogene | HC3110 | Used for lyophilizing liquid proteins |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-50KU | This is a component of 100x gloxy stock |
Guanidinium hydrochloride | Acros Organics | 364790025 | |
Hamilton syringe | Hamilton Company | 80065 | This syringe is used for sample injection |
Hellmanex III | Sigma | Z805939 | |
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg | Cytiva | 28-9893-36 | Used for FPLC (size exclusion) |
Hot plate stirrer | Corning | PC-420D | |
Hydrochloric acid | Sigma | H1759 | Used for Tris-HCl |
Index matching oil | ZEISS | 444970-9000-000 | |
Inductively coupled plasma-reactive ion etching | Top Technology Ltd. | FabStar | |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Glentham Life Sciences | GC6586-100g | Used for induction of β-galactosidase activity |
Lambda phage DNA | NEB | N0311 | |
LB broth | BD difco | 244610 | Media for E.coli cell growth |
Luer adapter 10-32 | IDEX | P-659 | This connects luer-lock syringe and tubing |
Magnesium chloride hexahydrate | fisher bioreagents | BP214 | |
Methyl isobutyl ketone (MIBK) | KAYAKU ADVANCED MATERIALS | Used for developing solution | |
Microscope (Eclipse Ti2) | Nikon | Eclipse Ti2 | Inverted fluorescence microscope |
Microscope glass coverslip | MARIENFELD | 101142 | 22 x 50 mm (No. 1) |
Microscope slide | DURAN GROUP | DU.2355013 | Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm |
Nanoport | IDEX | N-333-01 | |
Objective lens | Nikon | CFI Plan Apochromat VC 60XC WI | Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28) |
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C6060-03 | Competent cell for overexpressing proteins |
Oxygen (O2) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
PFA tubing natural | IDEX | 1512L | It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Roche | 11359061001 | Protease inhibitor |
Sephacryl S-200 High Resolution | Cytiva | 17-0584-01 | Used for FPLC (size exclusion) |
Shut-off valve | IDEX | P-732 | |
Sodium acetate | Sigma | 791741 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | s5881 | |
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa | Spectrum laboratories | 132660 | |
Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | S888 | |
Sulfur tetralfluoride (SF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
Syringe pump | KD Scientific | 78-8210 | |
Tetrafluoromethane (CF4) | NOBLEGAS, South Korea | Purity: >99.99% | |
TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
Trizma base | Sigma | T1503 | Used for Tris-HCl |
TSKgel SP-5PW | TOSOH | 14715 | Used for FPLC (ion exchange) |
Union assembly | IDEX | P-760 | This connects tubings |
Urea | Sigma | U5378 | |
Vacuum oven | Jeio Tech | OV-11 | |
YOYO-1 | Thermo Fisher Scientific | Y3601 | This intercalation dye is diluted in DMSO |
β-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M6250 |