Summary

Het ontcijferen van moleculair mechanisme van histonassemblage door DNA-gordijntechniek

Published: March 09, 2022
doi:

Summary

DNA-gordijn, een high-throughput single-molecule beeldvormingstechniek, biedt een platform voor real-time visualisatie van diverse eiwit-DNA-interacties. Het huidige protocol maakt gebruik van de DNA-gordijntechniek om de biologische rol en het moleculaire mechanisme van Abo1 te onderzoeken, een Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase.

Abstract

Chromatine is een structuur van hogere orde die eukaryotisch DNA verpakt. Chromatine ondergaat dynamische veranderingen afhankelijk van de fase van de celcyclus en als reactie op prikkels uit de omgeving. Deze veranderingen zijn essentieel voor genomische integriteit, epigenetische regulatie en DNA-metabole reacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie. Chromatine-assemblage is cruciaal voor de chromatinedynamiek en wordt gekatalyseerd door histon-chaperonnes. Ondanks uitgebreide studies blijven de mechanismen waarmee histon-chaperonnes chromatine-assemblage mogelijk maken, ongrijpbaar. Bovendien worden de globale kenmerken van nucleosomen georganiseerd door histon-chaperonnes slecht begrepen. Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit werk een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn genaamd, die het onderzoek van de moleculaire details van nucleosoomassemblage door histon-chaperonnes vergemakkelijkt. DNA-gordijn is een hybride techniek die lipidevloeibaarheid, microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) combineert om een universeel platform te bieden voor real-time beeldvorming van diverse eiwit-DNA-interacties. Met behulp van DNA-gordijn wordt de histon-chaperonnefunctie van Abo1, het Schizosaccharomyces pombe bromodomein-bevattende AAA+ ATPase, onderzocht en wordt het moleculaire mechanisme dat ten grondslag ligt aan histonassemblage van Abo1 onthuld. DNA-gordijn biedt een unieke benadering voor het bestuderen van chromatinedynamiek.

Introduction

Eukaryotisch DNA is verpakt in een structuur van hogere orde die bekend staat als chromatine 1,2. Nucleosoom is de fundamentele eenheid van chromatine, die bestaat uit ongeveer 147 bp DNA gewikkeld rond de octamere kernhistonen 3,4. Chromatine speelt een cruciale rol in eukaryote cellen; de compacte structuur beschermt bijvoorbeeld DNA tegen endogene factoren en exogene bedreigingen5. De chromatinestructuur verandert dynamisch afhankelijk van de fase van de celcyclus en omgevingsstimuli, en deze veranderingen regelen de toegang tot eiwitten tijdens DNA-transacties zoals replicatie, transcriptie en reparatie6. Chromatinedynamiek is ook belangrijk voor genomische stabiliteit en epigenetische informatie.

Chromatine wordt dynamisch gereguleerd door verschillende factoren, waaronder histonstaartmodificaties en chromatine-organisatoren zoals chromatine-remodelers, polycomb-groepeiwitten en histon-chaperonnes7. Histon-chaperonnes coördineren de assemblage en demontage van nucleosomen via afzetting of onthechting van kernhistonen 8,9. Defecten in histon-chaperonnes veroorzaken genoominstabiliteit en veroorzaken ontwikkelingsstoornissen en kanker 9,10. Verschillende histonchaperonnes hebben geen chemisch energieverbruik zoals ATP-hydrolyse nodig om nucleosomen te assembleren of te demonteren 9,11,12,13. Onlangs meldden onderzoekers dat broomdomein-bevattende AAA+ (ATPase geassocieerd met diverse cellulaire activiteiten) ATPases een rol spelen in de chromatinedynamiek als histonchaperonnes 14,15,16,17. Humaan ATAD2 (ATPase-familie AAA-domeinbevattend eiwit 2) bevordert de toegankelijkheid van chromatine om de genexpressie te verbeteren18. Als transcriptionele co-regulator reguleert ATAD2 het chromatine van oncogene transcriptionele factoren14, en de overexpressie van ATAD2 is gerelateerd aan een slechte prognose bij veel soorten kanker19. Yta7, de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) homoloog van ATAD2, verlaagt de nucleosoomdichtheid in chromatine15. Abo1 daarentegen, de Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) homoloog van ATAD2, verhoogt de nucleosoomdichtheid16. Met behulp van een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul, DNA-gordijn, wordt nagegaan of Abo1 bijdraagt aan nucleosoomassemblage of -demontage17,20.

Traditioneel worden de biochemische eigenschappen van biomoleculen onderzocht door middel van bulkexperimenten zoals de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) of co-immunoprecipitatie (co-IP), waarbij een groot aantal moleculen wordt onderzocht en hun gemiddelde eigenschappen worden gekarakteriseerd21,22. In bulkexperimenten worden moleculaire subtoestanden versluierd door het ensemble-gemiddelde effect en zijn het onderzoeken van biomoleculaire interacties beperkt. Daarentegen omzeilen technieken met één molecuul de beperkingen van bulkexperimenten en maken ze de gedetailleerde karakterisering van biomoleculaire interacties mogelijk. In het bijzonder zijn beeldvormingstechnieken met één molecuul op grote schaal gebruikt om DNA-eiwit en eiwit-eiwitinteracties te bestuderen23. Een van die technieken is DNA-gordijn, een unieke beeldvormingstechniek met één molecuul op basis van microfluïdica en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM)24,25. In een DNA-gordijn zijn honderden individuele DNA-moleculen verankerd aan de lipidedubbellaag, die de tweedimensionale beweging van DNA-moleculen mogelijk maakt als gevolg van lipidevloeibaarheid. Wanneer hydrodynamische stroming wordt toegepast, bewegen DNA-moleculen langs de stroom op de dubbellaag en komen vast te zitten bij een diffusiebarrière, waar ze worden uitgelijnd en uitgerekt. Terwijl DNA wordt gekleurd met intercalerende middelen, worden fluorescerend gelabelde eiwitten geïnjecteerd en wordt TIRFM gebruikt om eiwit-DNA-interacties in realtime te visualiseren op een niveau van één molecuul23. Het DNA-gordijnplatform vergemakkelijkt de observatie van eiwitbewegingen zoals diffusie, translocatie en botsing 26,27,28. Bovendien kan DNA-gordijn worden gebruikt voor het in kaart brengen van eiwitten op DNA met gedefinieerde posities, oriëntaties en topologieën of worden toegepast op de studie van fasescheiding van eiwitten en nucleïnezuren 29,30,31.

In dit werk wordt de DNA-gordijntechniek gebruikt om bewijs te leveren voor de functie van chaperonnes door middel van directe visualisatie van specifieke eiwitten. Omdat DNA-gordijn een high-throughput-platform is, vergemakkelijkt het bovendien een mate van gegevensverzameling die voldoende is voor statistische betrouwbaarheid. Hier wordt beschreven hoe de DNA-gordijntest in detail kan worden uitgevoerd om de moleculaire rol van S. pombe bromodomein-bevattend AAA+ ATPase Abo1 te onderzoeken.

Protocol

1. Voorbereiding van de flowcel Bereid een gereinigd gesmolten silicaglaasje voor met nano-greppelpatronen volgens eerder gepubliceerd rapport25.Boor twee gaten met een diameter van 1 mm in een gereinigd gesmolten silicaglaasje (Figuur 1A) met behulp van een diamantboor (zie Tabel met materialen). Breng 250 nm dik aluminium (Al) aan op het objectglaasje met behulp van DC-sputter32 (…

Representative Results

Dit werk beschrijft de procedure voor de voorbereiding van flowcellen voor de DNA-gordijntest (Figuur 1A). De DNA-gordijntest vergemakkelijkte de studie van histon H3-H4-dimeerassemblage op DNA door Abo1. Eerst werd de vorming van DNA-gordijnen gecontroleerd door DNA-moleculen te kleuren met YOYO-1, een intercalerende kleurstof. Groene lijnen werden getoond in parallelle arrays, wat aangeeft dat YOYO-1 intercaleerde in DNA-moleculen, die goed uitgelijnd waren en uitgerekt waren bij een diffu…

Discussion

Als beeldvormingstechniek met één molecuul is DNA-gordijn op grote schaal gebruikt om DNA-metabolische reacties te onderzoeken43. DNA-gordijn is een hybride systeem dat lipidevloeibaarheid, microfluïdica en TIRFM samenvoegt. In tegenstelling tot andere technieken met één molecuul, maakt DNA-gordijn real-time visualisatie van eiwit-DNA-interacties met hoge doorvoer mogelijk. Daarom is de DNA-gordijntechniek geschikt voor het onderzoeken van het mechanisme achter moleculaire interacties, waaron…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs waarderen de vriendelijke steun voor Abo1 en Cy5-H3-H4 door professor Ji-Joon Song, Carol Cho, Ph.D., en Juwon Jang, Ph.D., in KAIST, Zuid-Korea. Dit werk wordt ondersteund door de National Research Foundation Grant (NRF-2020R1A2B5B01001792), het intramurale onderzoeksfonds (1.210115.01) van het Ulsan National Institute of Science and Technology en het Institute for Basic Science (IBS-R022-D1).

Materials

1 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 301321
1' x 3' fused-silca slide glass G. Finkenbeiner 1 inch x 3 inch rectangular and 1 mm thickness
10 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302149
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) Avanti 850375 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 Biotinyl cap PE Avanti 870273 This is a component of biotinylated lipid stock
18:1 PEG2000 PE Avanti 880130 This is a component of biotinylated lipid stock
3 mL luer-lock syringe BecktonDickinson 302832
6-way sample injection valve IDEX MX series II
950K PMMA All-resist 671.04
Acetone SAMCHUN A1759
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma A2383
Aluminum (Al) TASCO, South Korea LT50AI414 Diameter 4 inch, thickness 1/4 inch
Amicon Ultra centrifugal filter, MWCO 10 kDa Millipore Z648027
Ampicillin Mbcell MB-A4128 Antibiotics
AZ 300 MIF developer Merck 10454110521 Used for removing aluminum
Blade DORCO DN52 12 mm x 6 m
Boron trichloride (BCl3) UNIONGAS Purity: >99.99%
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Catalase Sigma C40-1g This is a component of 100x gloxy stock
Chlorine (Cl2) UNIONGAS Purity: >99.99%
Clear double-sided tape 3M 313770
D-(+)-glucose Sigma G7528
DC sputter Sorona SRM-120 Used for deposition aluminum on a slide
Diamond-coated drill bit Eurotool DIB-211.00 Used for making holes in a fusced silica slide
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
Dove-prism Korea Electro-Optics Co. Ltd. 1906-106 Custom-made fused-silica dove prism with anti-reflection coating
Drill Dremel Dremel 3000 Used for making holes in a fusced silica slide
Electron Bean Lithography Nanobeam Ltd. NB3
Ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) Sigma EDS-1KG
Fingertight fittings IDEX F-300 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Flangeless male nut IDEX P-235 It is connected with "PFA Tubing Natural" to form luer-lock tubing
Freeze Dryer, HyperCOOL Labogene HC3110 Used for lyophilizing liquid proteins
Glucose oxidase Sigma G2133-50KU This is a component of 100x gloxy stock
Guanidinium hydrochloride Acros Organics 364790025
Hamilton syringe Hamilton Company 80065 This syringe is used for sample injection
Hellmanex III Sigma Z805939
HiLoad 26/600 SuperdexTM 200 pg Cytiva 28-9893-36 Used for FPLC (size exclusion)
Hot plate stirrer Corning PC-420D
Hydrochloric acid Sigma H1759 Used for Tris-HCl
Index matching oil ZEISS 444970-9000-000
Inductively coupled plasma-reactive ion etching Top Technology Ltd. FabStar
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Glentham Life Sciences GC6586-100g Used for induction of β-galactosidase activity
Lambda phage DNA NEB N0311
LB broth BD difco 244610 Media for E.coli cell growth
Luer adapter 10-32 IDEX P-659 This connects luer-lock syringe and tubing
Magnesium chloride hexahydrate fisher bioreagents BP214
Methyl isobutyl ketone (MIBK) KAYAKU ADVANCED MATERIALS Used for developing solution
Microscope (Eclipse Ti2) Nikon Eclipse Ti2 Inverted fluorescence microscope
Microscope glass coverslip MARIENFELD 101142 22 x 50 mm (No. 1)
Microscope slide DURAN GROUP DU.2355013 Slide glass ground edge 45°, plain 26 x 76 mm
Nanoport IDEX N-333-01
Objective lens Nikon CFI Plan Apochromat VC 60XC WI Immersion type: water, magnification: 60x, correction: 18, working distance: 0.29 (0.31-0.28)
One Shot BL21 (DE3)pLysS Chemically Competent E. coli Thermo Fisher Scientific C6060-03 Competent cell for overexpressing proteins
Oxygen (O2) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
PFA tubing natural IDEX 1512L It is connected with "Fingertight Fittings" to form luer-lock tubing
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Roche 11359061001 Protease inhibitor
Sephacryl S-200 High Resolution Cytiva 17-0584-01 Used for FPLC (size exclusion)
Shut-off valve IDEX P-732
Sodium acetate Sigma 791741
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma s5881
Spectra/Por molecularporous membrane tubing, MWCO 6-8 kDa Spectrum laboratories 132660
Streptavidin Thermo Fisher Scientific S888
Sulfur tetralfluoride (SF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
Syringe pump KD Scientific 78-8210
Tetrafluoromethane (CF4) NOBLEGAS, South Korea Purity: >99.99%
TritonX-100 Sigma T9284
Trizma base Sigma T1503 Used for Tris-HCl
TSKgel SP-5PW TOSOH 14715 Used for FPLC (ion exchange)
Union assembly IDEX P-760 This connects tubings
Urea Sigma U5378
Vacuum oven Jeio Tech OV-11
YOYO-1 Thermo Fisher Scientific Y3601 This intercalation dye is diluted in DMSO
β-mercaptoethanol (BME) Sigma M6250

References

  1. Woodcock, C. L., Ghosh, R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (5), 000596 (2010).
  2. Kim, K., Eom, J., Jung, I. Characterization of structural variations in the context of 3D chromatin structure. Molecules and Cells. 42 (7), 512-522 (2019).
  3. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  4. McGhee, J. D., Felsenfeld, G. Nucleosome structure. Annual Review of Biochemistry. 49, 1115-1156 (1980).
  5. Takata, H., et al. Chromatin compaction protects genomic DNA from radiation damage. PLOS One. 8 (10), 75622 (2013).
  6. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  7. Peterson, C. L., Almouzni, G. Nucleosome dynamics as modular systems that integrate DNA damage and repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), 012658 (2013).
  8. Torigoe, S. E., Urwin, D. L., Ishii, H., Smith, D. E., Kadonaga, J. T. Identification of a rapidly formed nonnucleosomal histone-DNA intermediate that is converted into chromatin by ACF. Molecules and Cells. 43 (4), 638-648 (2011).
  9. Gurard-Levin, Z. A., Quivy, J. P., Almouzni, G. Histone chaperones: assisting histone traffic and nucleosome dynamics. Annual Review of Biochemistry. 83, 487-517 (2014).
  10. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  11. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  12. Hammond, C. M., Stromme, C. B., Huang, H., Patel, D. J., Groth, A. Histone chaperone networks shaping chromatin function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (3), 141-158 (2017).
  13. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: an escort network regulating histone traffic. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  14. Zou, J. X., Revenko, A. S., Li, L. B., Gemo, A. T., Chen, H. W. ANCCA, an estrogen-regulated AAA+ ATPase coactivator for ERalpha, is required for co-regulator occupancy and chromatin modification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18067-18072 (2007).
  15. Lombardi, L. M., Davis, M. D., Rine, J. Maintenance of nucleosomal balance in cis by conserved AAA-ATPase Yta7. 유전학. 199 (1), 105-116 (2015).
  16. Gal, C., et al. Abo1, a conserved bromodomain AAA-ATPase, maintains global nucleosome occupancy and organisation. EMBO Reports. 17 (1), 79-93 (2016).
  17. Cho, C., et al. Structural basis of nucleosome assembly by the Abo1 AAA+ ATPase histone chaperone. Nature Communications. 10 (1), 5764 (2019).
  18. Morozumi, Y., et al. Atad2 is a generalist facilitator of chromatin dynamics in embryonic stem cells. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (4), 349-362 (2016).
  19. Zhang, M., Zhang, C., Du, W., Yang, X., Chen, Z. ATAD2 is overexpressed in gastric cancer and serves as an independent poor prognostic biomarker. Clinical and Translational Oncology. 18 (8), 776-781 (2016).
  20. Kang, Y., Cho, C., Lee, K. S., Song, J. J., Lee, J. Y. Single-molecule imaging reveals the mechanism underlying histone loading of schizosaccharomyces pombe AAA+ ATPase Abo1. Molecules and Cells. 44 (2), 79-87 (2021).
  21. Fried, M. G. Measurement of protein-DNA interaction parameters by electrophoresis mobility shift assay. Electrophoresis. 10 (5-6), 366-376 (1989).
  22. Kessler, S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A. Journal of Immunology. 115 (6), 1617-1624 (1975).
  23. Lu, H. P. Single-molecule study of protein-protein and protein-DNA interaction dynamics. Methods in Molecular Biology. 305, 385-414 (2005).
  24. Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24 (18), 10524-10531 (2008).
  25. Kang, Y., et al. High-throughput single-molecule imaging system using nanofabricated trenches and fluorescent DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1640-1648 (2020).
  26. Cheon, N. Y., Kim, H. S., Yeo, J. E., Scharer, O. D., Lee, J. Y. Single-molecule visualization reveals the damage search mechanism for the human NER protein XPC-RAD23B. Nucleic Acids Research. 47 (16), 8337-8347 (2019).
  27. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecules and Cells. 54 (5), 832-843 (2014).
  28. Kang, H. J., et al. TonEBP recognizes R-loops and initiates m6A RNA methylation for R-loop resolution. Nucleic Acids Research. 49 (1), 269-284 (2021).
  29. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  30. Visnapuu, M. L., Greene, E. C. Single-molecule imaging of DNA curtains reveals intrinsic energy landscapes for nucleosome deposition. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (10), 1056-1062 (2009).
  31. Stigler, J., Camdere, G. O., Koshland, D. E., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals a collapsed conformational state for DNA-bound cohesin. Cell Reports. 15 (5), 988-998 (2016).
  32. Thornton, J. A. Sputter Coating- Its Principles and Potential. SAE Transactions. 82, 1787-1805 (1973).
  33. Grigorescu, A. E., Hagen, C. W. Resists for sub-20-nm electron beam lithography with a focus on HSQ: state of the art. Nanotechnology. 20 (29), 292001 (2009).
  34. Meir, A., Kong, M., Xue, C., Greene, E. C. DNA curtains shed light on complex molecular systems during homologous recombination. Journal of Visualized Experiments. (160), e61320 (2020).
  35. Cold Spring Harbor Protocols. Gloxy. Vol. 2. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  36. Gracey, L. E., et al. An in vitro-identified high-affinity nucleosome-positioning signal is capable of transiently positioning a nucleosome in vivo. Epigenetics Chromatin. 3 (1), 13 (2010).
  37. Subtil-Rodriguez, A., Reyes, J. C. BRG1 helps RNA polymerase II to overcome a nucleosomal barrier during elongation, in vivo. EMBO Reports. 11 (10), 751-757 (2010).
  38. Lancrey, A., et al. Nucleosome positioning on large tandem DNA repeats of the ‘601’ sequence engineered in Saccharomyces cerevisiae. bioRxiv. , (2021).
  39. Perales, R., Zhang, L., Bentley, D. Histone occupancy in vivo at the 601 nucleosome binding element is determined by transcriptional history. Molecular and Cellular Biology. 31 (16), 3485-3496 (2011).
  40. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  41. Rossmann, K. Point spread-function, line spread-function, and modulation transfer function. Tools for the study of imaging systems. Radiology. 93 (2), 257-272 (1969).
  42. Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1224-1229 (2009).
  43. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  44. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
  45. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  46. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  47. Teif, V. B., Rippe, K. Nucleosome mediated crosstalk between transcription factors at eukaryotic enhancers. Physical Biology. 8 (4), 044001 (2011).

Play Video

Cite This Article
Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique. J. Vis. Exp. (181), e63501, doi:10.3791/63501 (2022).

View Video