Esplorare l'interazione biomolecolare tra lo chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi cliente Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo

Interazioni biomolecolari:
Le proteine sono parti essenziali degli organismi e partecipano a numerosi percorsi molecolari come il metabolismo cellulare, la struttura cellulare, la segnalazione cellulare, le risposte immunitarie, l’adesione cellulare e altro ancora. Mentre alcune proteine svolgono le loro funzioni in modo indipendente, la maggior parte delle proteine interagisce con altre proteine utilizzando un’interfaccia di legame per coordinare la corretta attività biologica¹.

Le interazioni biomolecolari possono essere classificate principalmente in base alle distinte caratteristiche strutturali e funzionali delle proteine coinvolte², ad esempio in base alle superfici proteiche, alla stabilità complessa o alla persistenza delle interazioni³. Identificare le proteine essenziali e il loro ruolo nelle interazioni biomolecolari è vitale per comprendere i meccanismi biochimici a livello molecolare⁴. Attualmente, ci sono vari approcci per rilevare queste interazioni⁵: in vitro⁶, in silico⁷, in cellule vive⁸, ex vivo⁹ e in vivo¹⁰ con ciascuno con i propri punti di forza e di debolezza.

I saggi in vivo vengono eseguiti utilizzando l’intero animale come strumento sperimentale¹¹ e i saggiex vivo vengono eseguiti su estratti di tessuto o organi interi (ad esempio, cuore, cervello, fegato) in un ambiente esterno controllato fornendo alterazioni minime in condizioni naturali. L’applicazione più comune degli studi in vivo ed ex vivo è quella di valutare gli effetti di farmacocinetica, farmacodinamica e tossicità dei potenziali agenti farmacologici prima degli studi sull’uomo, garantendone la sicurezza e l’efficacia complessive¹².

Le interazioni biomolecolari possono anche essere rilevate all’interno delle cellule viventi. L’imaging di cellule vive ci consente di osservare le interazioni dinamiche mentre eseguono le reazioni di un particolare percorso biochimico¹³. Inoltre, le tecniche di rilevamento, come la bioluminescenza o il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza, possono fornire informazioni su dove e quando queste interazioni si verificano all’interno della cellula¹⁴. Sebbene il rilevamento in cellule vive offra dettagli cruciali, queste metodologie di rilevamento si basano su ottiche ed etichette, che potrebbero non riflettere la biologia nativa; sono anche meno controllati rispetto ai metodi in vitro e richiedono competenze specializzate per eseguire¹⁵.

I metodi computazionali in silico sono utilizzati principalmente per lo screening su larga scala delle molecole bersaglio prima degli esperimenti in vitro . Metodi di previsione computazionale, database basati su computer, docking molecolare, relazioni quantitative struttura-attività e altri approcci di simulazione della dinamica molecolare sono tra gli strumenti consolidati in silico ¹⁶. Rispetto alle laboriose tecniche sperimentali, gli strumenti in silico possono facilmente fare previsioni con alta sensibilità, ma con precisione ridotta nelle prestazioni predittive¹⁷.

I saggi in vitro vengono eseguiti con microrganismi o molecole biologiche al di fuori del loro contesto biologico standard. Ritrarre le interazioni biomolecolari attraverso metodi in vitro è fondamentale per comprendere le funzioni proteiche e la biologia alla base della complessa rete di funzionamento cellulare. La metodologia di analisi preferita viene scelta in base alle proprietà intrinseche della proteina, ai valori cinetici e alla modalità e intensità delle interazioni^18,19.

L’interazione Hsp90/Cdc37:
La via chaperone-chinasi, che collega Hsp90 e Cdc37, è un obiettivo terapeutico promettente nella biologia tumorale²⁰. Hsp90 svolge un ruolo centrale nel controllo del ciclo cellulare, nell’assemblaggio delle proteine, nella sopravvivenza cellulare e nelle vie di segnalazione. Le proteine che si basano su Hsp90 per le loro funzioni vengono consegnate a Hsp90 per la complessazione attraverso un co-chaperone, come Cdc37. Il complesso Hsp90/Cdc37 controlla il ripiegamento della maggior parte delle protein chinasi e funge da hub per una moltitudine di reti di segnalazione intracellulare²¹. È un promettente bersaglio antitumorale grazie alla sua elevata espressione in varie neoplasie maligne, tra cui la leucemia mieloblastica acuta, il mieloma multiplo e il carcinoma epatocellulare^22,23.

Tecniche di rilevamento dell’interazione biomolecolare in vitro comunemente usate
La co-immunoprecipitazione (co-IP) è una tecnica che si basa sulla specificità antigene-anticorpo per identificare interazioni biologicamente rilevanti²⁴. Lo svantaggio principale di questo metodo è la sua incapacità di rilevare interazioni a bassa affinità e valori cinetici²⁴. I metodi biofisici come la calorimetria a titolazione isotermica (ITC), la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l’interferometria a biostrato (BLI) e la tecnologia FEB sono preferiti per determinare i valori cinetici.

ITC è un metodo di rilevazione biofisica basato sulla determinazione dell’energia di legame insieme a un’analisi termodinamica completa per caratterizzare le interazioni biomolecolari²⁵. Il vantaggio principale dell’ITC è che non richiede alcuna etichettatura o fissazione della proteina bersaglio. Le principali difficoltà incontrate dall’ITC sono l’alta concentrazione di proteine bersaglio richieste per un esperimento e la difficoltà di analizzare complessi non covalenti a causa di piccole entalpie di legame²⁶. Sia SPR che BLI sono tecniche biofisiche label-free che si basano sull’immobilizzazione della molecola bersaglio sulla superficie del sensore, seguita da successive iniezioni dell’analita sul bersaglio immobilizzato^27,28. In SPR, le alterazioni dell’indice di rifrazione durante le interazioni biomolecolari sono misurate²⁷; in BLI, l’interferenza nella luce riflessa viene registrata in tempo reale come variazione della lunghezza d’onda in funzione del tempo²⁸. Sia SPR che BLI condividono i vantaggi comuni di offrire elevate funzionalità di specificità, sensibilità e rilevamento²⁹. In entrambi i metodi, la proteina bersaglio è immobilizzata sulle superfici del biosensore e, quindi, potrebbe esserci una certa perdita della conformazione nativa del bersaglio, il che rende difficile discriminare tra interazioni specifiche e non specifiche³⁰. BLI utilizza costosi biosensori monouso in fibra ottica per immobilizzare il bersaglio ed è, quindi, una tecnica costosa³¹. Rispetto a questi strumenti di rilevamento biomolecolari consolidati, la tecnologia FEB offre una piattaforma affidabile e priva di etichette utilizzando basse concentrazioni nanomolari per il rilevamento biomolecolare in tempo reale con caratterizzazione cinetica. La tecnologia FEB supera anche le sfide spumeggianti affrontate in ITC ed è più conveniente rispetto a SPR o BLI.

I biosensori basati su transistor ad effetto di campo (FET) sono un campo emergente per rilevare interazioni biomolecolari offrendo varie applicazioni biomediche. Nel sistema FET, i bersagli sono immobilizzati ai chip del biosensore e le interazioni vengono rilevate dai cambiamenti nella conduttanza³². La caratteristica unica da considerare nello sviluppo di un biosensore elettronico efficiente sono le proprietà fisico-chimiche come la natura semi-conduttiva e la stabilità chimica del materiale di rivestimento utilizzato per fabbricare la superficie del sensore³³. I materiali convenzionali come il silicio utilizzato per il FET hanno limitato la sensibilità dei sensori perché richiede strati di ossido inseriti tra il canale del transistor e un ambiente specifico per il corretto funzionamento³⁴. Inoltre, i transistor al silicio sono sensibili agli ambienti ad alto contenuto di sale, rendendo così difficile misurare le interazioni biologiche nel loro ambiente naturale. Il biosensore a base di grafene si presenta come un’alternativa in quanto offre un’eccellente stabilità chimica e campo elettrico. Poiché il grafene è un singolo strato atomico di carbonio, è sia estremamente sensibile come semiconduttore che chimicamente compatibile con soluzioni biologiche; entrambe queste qualità sono desiderabili per generare biosensori elettronici compatibili³⁵. Il notevole potenziale di carico ultra elevato delle biomolecole offerto dai biosensori rivestiti di grafene ha portato allo sviluppo della tecnologia FEB dei biosensori a base di grafene.

Principio della tecnologia FEB: FEB è una tecnica di rilevamento biomolecolare senza etichetta che misura la corrente elettrica attraverso il biosensore di grafene a cui sono immobilizzati i bersagli di legame. Le interazioni tra la proteina immobilizzata e l’analita provocano alterazioni della corrente che vengono monitorate in tempo reale, consentendo misurazioni cinetiche accurate³⁶.

Strumentazione: Il sistema FEB comprende un chip sensore a transistor a effetto di campo del grafene (gFET) e un lettore elettronico che applica una tensione costante durante l’esperimento (Figura 1). L’analita viene applicato in soluzione alla proteina bersaglio immobilizzata sulla superficie del biosensore. Quando si verifica un’interazione, un’alterazione della corrente viene misurata e registrata in tempo reale. All’aumentare della concentrazione dell’analita, aumenterà anche la frazione di analita legato, causando maggiori alternanze nella corrente. Utilizzando il software di analisi automatizzato fornito con lo strumento (Table of Materials), I-Response viene misurato e registrato in termini di unità di biorilevamento (BU)³⁷. I-Response è definita come l’alterazione della corrente (I) attraverso il chip del biosensore misurata in tempo reale sull’interazione del bersaglio immobilizzato con l’analita. Il software di analisi automatizzata FEB può analizzare sia l’I-Response che il C-Response a eventi di interazione dinamica, dove il C-Response registra le alterazioni della capacità (C). Le variazioni sia in I-Response che in C-Response corrispondono direttamente alla frazione di analita legato e possono essere ulteriormente analizzate per generare valori K_D . La preferenza predefinita del software di analisi automatizzata è I-Response.

Figura 1: Panoramica della configurazione sperimentale. (A) Chip a base di grafene e lettore elettronico. (B) Una panoramica dei componenti del chip. Il chip è collegato a due elettrodi che forniscono corrente al sistema. La superficie del chip è ricoperta di grafene, che una volta attivato può legare il bersaglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodologia:
Inizialmente, il chip del biosensore attivato viene inserito nel dispositivo FEB (Figura 1) seguito dall’esecuzione dei passaggi descritti di seguito: (1) Calibrazione: l’esperimento inizia con la calibrazione del sistema utilizzando 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; pH = 7,4) per creare la risposta di equilibrio basale. (2) Associazione: l’analita viene introdotto nel chip e l’I-Response viene monitorato fino al raggiungimento della saturazione del legame. (3) Dissociazione: l’analita viene dissociato utilizzando 1x PBS. (4) Rigenerazione: i resti dell’analita vengono rimossi utilizzando 1x PBS. (5) Lavaggio: un totale di cinque lavaggi vengono eseguiti utilizzando 1x PBS per la rimozione completa degli analiti legati e non legati dal chip.

Analisi:
L’analisi dei dati viene eseguita utilizzando il software completamente automatizzato fornito con lo strumento. Il software di analisi automatizzato genera un grafico Hill fit con un valore K_D . Il diagramma di Hill fit descrive l’associazione di un analita alla proteina bersaglio in funzione delle concentrazioni di analiti. La concentrazione alla quale si ottiene una risposta semi-massimale è proporzionale al valore K_D . Un valore K_D basso rappresenta un’elevata affinità di legame e viceversa.

Per convalidare i dati ottenuti dall’esperimento FEB, le I-Response vengono estratte da ciascun punto di lettura per ogni concentrazione di analita utilizzando il software di revisione/esportazione dei dati e possono essere esportate in altri software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali) come spiegato di seguito.