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생물학

Isolierung und Charakterisierung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63481
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario,Universidad de Córdoba, 3i3S – Instituto de Investigação e Inovação em Saúde,Universidade do Porto, 4IBMC – Instituto de Biologia Molecular e Celular,Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar,Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências,Universidade do Porto

Summary

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die Isolierung, Konzentration und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus Cyanobakterienkulturen. Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kulturen auf verschiedenen Skalen, Kompromisse zwischen den Methoden und Überlegungen zur Arbeit mit Feldproben werden ebenfalls diskutiert.

Abstract

Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von photosynthetischen, gramnegativen Bakterien, die eine entscheidende Rolle in globalen Ökosystemen spielen und als wesentliche biotechnologische Modelle dienen. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass sowohl marine als auch Süßwassercyanobakterien extrazelluläre Vesikel produzieren – kleine membrangebundene Strukturen, die von der äußeren Oberfläche der Mikroben freigesetzt werden. Während Vesikel wahrscheinlich zu verschiedenen biologischen Prozessen beitragen, bleiben ihre spezifischen funktionellen Rollen in der Cyanobakterienbiologie weitgehend unbekannt. Um die Forschung in diesem Bereich zu fördern und voranzutreiben, wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung, Konzentration und Reinigung von zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln vorgestellt. Die aktuelle Arbeit diskutiert Methoden, die erfolgreich Vesikel aus großen Kulturen von Prochlorococcus, Synechococcus und Synechocystis isoliert haben. Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Vesikelproben aus diesen Stämmen werden vorgestellt. Ansätze zur Isolierung von Vesikeln aus aquatischen Feldproben werden ebenfalls beschrieben. Schließlich werden auch typische Herausforderungen bei der Reinigung zyanobakterieller Vesikel, methodische Überlegungen für verschiedene nachgelagerte Anwendungen und die Zielkonflikte zwischen den Ansätzen diskutiert.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind sphärische Strukturen mit einem Durchmesser zwischen ~ 20-400 nm, die von praktisch allen Organismen in ihre Umgebung freigesetztwerden 1,2,3. Vesikel sind durch eine Lipiddoppelschicht begrenzt und können sich nicht selbst replizieren. Bei gramnegativen Bakterien wird angenommen, dass diese Strukturen hauptsächlich durch “Blöken” kleiner Teile aus der äußeren Membran entstehen. Dennoch können andere Prozesse, einschließlich der Flagellenbewegung, der Zelllyse und der Sekretion von innerem und äußerem Membranmaterial, ebenfallsVesikel produzieren 4,5. EVs können verschiedene Biomoleküle enthalten, einschließlich Lipide, lösliche und Membranproteine, Nukleinsäuren und Metaboliten, und können dieses Material zwischen den Zellentransportieren 4,5,6. Angesichts dieser Merkmale werden EVs untersucht, um ihre mögliche Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen zu verstehen, einschließlich zellulärer Kommunikation, Biofilmbildung, horizontalem Gentransfer, Wirt-Phagen-Dynamik und Nährstoffaustausch 4,6.

Cyanobakterien sind eine große und vielfältige Gruppe von gramnegativen Bakterien, einschließlich einzelliger und fadenförmiger Organismen. Sie sind aus vielen Perspektiven von Interesse, einschließlich des Verständnisses ihrer Physiologie und Vielfalt7,8, der kritischen Ökosystemfunktionen, denen sie dienen 9,10, und ihres Nutzens für die Biotechnologie 11,12. Cyanobakterien kommen in einer Vielzahl von Lebensräumen vor, entweder als frei lebende Organismen in Meeres-, Süßwasser- und terrestrischen Umgebungen oder in symbiotischen Assoziationen mit Moosen, Farnen, Pflanzen oder in Flechten und Schwämmen13. Sie dienen als entscheidende Primärproduzenten in aquatischen Ökosystemen und produzieren Sauerstoff und organischen Kohlenstoff durch sauerstoffhaltige Photosynthese 9,10, und einige sind in der Lage, auch atmosphärischen Stickstoff zu fixieren 7. Marine und Süßwassercyanobakterien, einschließlich Prochlorococcus, Synechococcus und Synechocystis, produzieren EVs unter Laborbedingungen 14,15,16, und Cyanobakterienvesikel können auch in natürlichen Umgebungen gefunden werden 14,17. Die biologischen und ökologischen Funktionen von cyanobakteriellen Vesikeln sind unbekannt, aber weitere Forschungen auf diesem Gebiet werden wahrscheinlich neue Einblicke in Fragen der zyanobakteriellen Physiologie, Differenzierung, Kommunikationsstrategien, Evolution und trophischen Interaktionen liefern. Darüber hinaus kann die Fähigkeit cyanobakterieller EVs, verschiedene Kategorien von Biomolekülen zu tragen, kommerzielle Anwendungen haben18,19.

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von Vesikeln aus cyanobakteriellen Kulturen und Feldproben, um eine breitere Untersuchung der zyanobakteriellen extrazellulären Vesikelbiologie zu ermöglichen und zu fördern. Während der hier beschriebene Workflow analog zu Protokollen zur Isolierung und Charakterisierung von EVs aus anderen Bakterien ist, enthalten cyanobakterielle Kulturen und Feldproben typischerweise niedrigere Zell- und Vesikelkonzentrationen, als dies bei wirtsassoziierten oder pathogenen Modellsystemen üblicherweise beobachtet wird20,21,22. Daher erfordern Untersuchungen von cyanobakteriellen EVs besondere Überlegungen und Optimierungen für die Kultivierung und Vesikelisolierung, die zwischen Stämmen und Medienhintergründen weiter variieren. Da kein einzelnes Protokoll für alle Stämme, Wachstumsbedingungen und nachgelagerten Anwendungen gleich gut funktioniert, bieten wir mehrere Optionen und diskutieren die damit verbundenen Kompromisse, damit die Forscher die Ansätze bestimmen können, die für die Behandlung ihrer experimentellen Fragen am besten geeignet sind.

Protocol

Die Cyanobakterienstämme stammen aus mehreren Kultursammlungen (siehe Diskussion für Details). 1. Cyanobakterielle Kultivierung Kultivieren Sie marine Cyanobakterien Prochlorococcus und Synechococcus mit den folgenden Schritten . Kultivieren Sie Prochlorococcus- und Synechococcus-Stämme in Polycarbonatkolben mit einem geeigneten Medium wie Pro99 oder SN (siehe Materialtabelle). Einzelheiten entnehmen Sie bitte den zuvor veröffentlichten Referenzen23,24. Akklimatisieren Sie die Kulturen, indem Sie sie über zwei bis drei Transfers (1:20 Verdünnungen der Kultur in frische Medien für jede Passage) unter den für das Experiment erforderlichen Temperatur- und Bestrahlungsstärkebedingungen züchten.HINWEIS: Typische Wachstumsbedingungen 23,25 umfassen Temperaturen zwischen 15-30 °C bei einer Bestrahlungsstärke zwischen 8-150 μmol Photonen m-2 s-1, aber individuelle Dehnungstoleranzen und Optima variieren stark26 und müssen auf der Grundlage der Richtlinien der relevanten Kultursammlungsanleitung oder Literatur eingestellt werden. Überwachen Sie die Wachstumsrate mithilfe von Kulturfluoreszenz- oder Durchflusszytometrie-Zählungen23 und stellen Sie sicher, dass Kulturen mit einer konsistenten stetigen exponentiellen Rate wachsen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Führen Sie eine Reihe von aufeinanderfolgenden allmählichen Transfers von kleineren zu größeren Volumina durch, sobald die Zellen die späte exponentielle Phase erreicht haben (z. B. 20 ml < 250 ml < 2 l < 10 l < 20 l).HINWEIS: Kulturen mit großem Volumen können nicht direkt aus kleinen Mengen der Ausgangskultur geimpft werden. Beachten Sie, dass größere Kulturen die Zugabe von Puffern (z. B. 1 mM HEPES, pH 7,5 oder 3,75 mM TAPS, pH 8) zusammen mit zusätzlichem Natriumbicarbonat oder Sprudeln mit steriler Lufterfordern können 24. Kultivieren Sie Süßwassercyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. Bereiten Sie eine Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 vor, die als Inokulum verwendet werden soll, indem Sie sie mit Belüftung (sprudelnde Luft bei 1 l / min), bei 30 ° C, unter einem 16 h hellen Licht (Photonenzahl von 50 μmol m-2 s-1) / 8 h dunklem Regime, bis zu einer optischen Dichte bei 730 nm (OD730) von 1,0 (exponentielle Phase) in BG11 medium27 kultivieren. 30 ml dieser Kultur Synechocystis sp. PCC 6803 in 570 ml BG11 medium zu einem OD730 von 0,05 in 1 L Glasgaswaschflaschen impfen. Lassen Sie die Zellen mit Belüftung bei 30 ° C unter einem 16 h hellen Licht (Photonenzahl von 50 μmol m-2 s-1) / 8 h dunklem Regime bis zu einem endgültigen OD730 von 1,0-1,5 wachsen. 2. Abtrennung von cyanobakterieller Biomasse aus der Kleinpartikelfraktion (Vesikelfraktion) HINWEIS: Zunächst wird empfohlen, Zellen durch zentrifugale Pelletierung von Zellen vom Überstand zu trennen. Wenn jedoch die Kulturvolumina zu groß sind, um dies zu ermöglichen, ist es möglich, die Zentrifugation zu überspringen und direkt mit der Filterung ganzer Kulturen mittels Kapselfiltration (Schritt 2.4) fortzufahren. Zentrifugation durchzuführen, um Zellen zu trennen (am besten für Volumina bis zu ~ 4 l, abhängig von der verfügbaren Zentrifugenkapazität). Autoklav oder gründlich waschen und reinigen Sie die Zentrifugenflaschen mit Reinstwasser Typ I (siehe Materialtabelle), um sicherzustellen, dass keine Restseife oder anderes Material übrig bleibt. Laden Sie Kulturproben in eine angemessene Anzahl von Zentrifugenflaschen und balancieren Sie sie aus. Spinnkulturen für >10.000 x g bei 4 °C für 10 min. Wenn der Überstand sichtbar trüb bleibt, erhöhen Sie die Zentrifugationsbedingungen bei maximaler Geschwindigkeit auf 20 Minuten und versuchen Sie es erneut. Dekantieren oder pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in ein sauberes Gefäß und fahren Sie mit einer der folgenden Filtrationsoptionen fort, die in den Schritten 2.2-2.4 erwähnt werden. Option 1: Spritzenfiltration mit 0,2-μm-Filtern (für Probenvolumina bis zu ~50 ml). Füllen Sie eine sterile 50-ml-Spritze mit einem weitgehend zellfreien Kulturmedium und filtern Sie sie durch einen 0,2 (oder 0,45) μm-Polyethersulfonfilter (PES) (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie das Filtrat in einem sauberen, sterilisierten Behälter. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis der Filter verstopft ist (z. B. wird es schwierig, mit der Spritze zu drücken). Ersetzen Sie durch einen neuen Filter, und fahren Sie fort, bis die Probe gründlich gefiltert ist. Option 2: Durchführung einer Vakuumfiltration von 0,2 μm (bis zu ~4 l). Waschen und reinigen Sie das Vakuumgerät gründlich mit Typ I – Reinstwasser und schließen Sie es an eine Vakuumfalle und eine Pumpe an (siehe Materialtabelle). Setzen Sie einen 0,2-μm-Filter mit einem geeigneten Durchmesser ein und klemmen Sie die Vakuumvorrichtung ein. Fügen Sie eine kleine Menge Kulturprobe hinzu, um sicherzustellen, dass der Vakuumdruck <10 psi bleibt. Fahren Sie mit dem Filtern der Kultur in kleinen Schritten fort, bis der Vorgang abgeschlossen ist. Wenn sich die Filtrationsrate deutlich verlangsamt, stoppen Sie das Vakuum und ersetzen Sie den Filter. Sammeln Sie die <0,2 μm Fraktion enthaltenden Vesikel in einem sauberen Behälter. Option 3: Durchführung einer Kapselfiltration von 0,2 μm (für Probenvolumina >~4 l) Reinigen Sie geeignete flexible Schläuche und Auffangbehälter durch Waschen mit Wasser und mildem Reinigungsmittel. Spülen Sie das Material mit destilliertem und entionisiertem Wasser ab.HINWEIS: Vor der Verwendung sollte das Material mit Typ I – Reinstwasser – gespült werden. Platzieren Sie die zu filternde Kultur an einem sicheren, erhöhten Ort mit dem endgültigen Sammelgefäß darunter. Schließen Sie einen 0,2-μm-Kapselfilter (siehe Materialtabelle) an ein Stück Schlauch an und legen Sie ihn in ein Auffanggefäß. Legen Sie einen weiteren Schlauch in die Probe, beginnen Sie einen Schwerkraftsiphon, indem Sie mit einer Spritze eine Probe in den Schlauch ziehen, und verbinden Sie den Schlauch mit dem Kapselfilter. Verwenden Sie die Entlüftung, um überschüssige Luft freizusetzen und füllen Sie die Kammer mit Überstand. Lassen Sie das Material durch die Kapsel wandern, bis die Probe gründlich gefiltert ist. Wenn die Durchflussrate zu langsam wird (< ~ 1/10 der Startflussrate oder im Gegensatz zu einem kontinuierlichfließenden Strom tropfenweise herauskommt), warten Sie oder wenden Sie sanfte Kraft mit einer Peristaltikpumpe an, bis der Gegendruck zunimmt. Alternativ können Sie die Durchflussraten teilweise wiederherstellen, indem Sie den Filter vorübergehend abschalten, angesammelte Biomasse von der Zuflussseite mit ultrareinem Wasser rückspülen, bis das Material nicht mehr sichtbar trüb ist, und dann den Filtrationsprozess neu starten. 3. Konzentration der Vesikelprobe Option 1: Zentrifugal-Ultrafiltration zur Konzentration kleiner Proben (<500 ml) Proben. Spülen Sie die 15-20 ml Ultrafiltrationszentrifugalkonzentratoren Ihrer Wahl mit Typ I – Reinstwasser. Laden Sie die Konzentratoren in die Zentrifuge und drehen Sie sie bei 4.400 x g bei 4 °C. Verwerfen Sie den Durchlauf und wiederholen Sie diesen Schritt mindestens zweimal mehr. Laden Sie die überstehende Probe in wassergespülte Konzentratoren und drehen Sie sie unter den gleichen Bedingungen. Abhängig von den experimentellen Zielen kann das Probenfiltrat verworfen oder zur weiteren Konzentration (mit Konzentratoren mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 3 kDa) und zur Analyse gesammelt werden. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Probe auf ein Endvolumen von ~ 15-30 ml konzentriert ist. Option 2: Führen Sie eine Tangentialflussfiltration (TFF) durch, um ein großes Probevolumen (>500 ml) zu konzentrieren. Richten Sie das TFF-Gerät gemäß den Richtlinien des Herstellers ein (siehe Materialtabelle). Befestigen Sie eine Peristaltikpumpe an der Ansaugleitung und platzieren Sie verstellbare Klemmen an der Retentatorleitung. Desinfizieren Sie die TFF wie vom Hersteller empfohlen und spülen Sie das Gerät dann mit 1 L Typ I – Reinstwasser.HINWEIS: Die Ansaug- und Retentionsleitungen sollten in ein sauberes Probenreservoir (Glasflasche) gegeben werden. Filtratleitung(en) sollten in ein Abfallschiff oder eine Spüle geleitet werden. Geben Sie <0,2 μm Filtrat in das Probenreservoir. Erhöhen Sie langsam die Pumpendrehzahl und den Gegendruck auf der Retentatleitung, um die Leistung der Filtratleitungen zu erhöhen. Fahren Sie mit dem TFF fort und füllen Sie das Reservoir mit Kulturüberständen auf, wenn das Material entfernt wird. Vermeiden Sie es, dass die Ansaugleitung während der Verarbeitung aus der Probe herauskommt, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass der Zufuhrdruck ~10 psi nicht überschreitet und dass das Retentat in gleichmäßiger Geschwindigkeit aus dem TFF zurück in das Reservoir fließt. Stoppen Sie die Konzentration der Probe, sobald das Volumen im Reservoir die geringstmögliche Menge erreicht hat, die erforderlich ist, um den Durchfluss in die Ansaugleitung aufrechtzuerhalten, ohne Luftblasen einzuführen. Schließen Sie die Abflussleitung mit einer Klemme. Entfernen Sie den Gegendruck auf der Retentatleitung und rezirkulieren Sie den konzentrierten Überstand für ~ 10 min durch den Filter, wodurch die Rezirkulationsrate auf 20-40 ml / min reduziert wird, um die Ausbeute zu maximieren. Bewegen Sie die Retentatlinie in ein sauberes Gefäß, entfernen Sie die Ansaugleitung aus der Probe und sammeln Sie das konzentrierte Material. Das verbleibende Material im Probenbehälter wird mit einer Pipette zurückgewonnen. Filtern Sie den konzentrierten Überstand durch einen 0,2 μm Spritzenfilter (Schritt 2.2), um sicherzustellen, dass keine Zellen zurückbleiben.HINWEIS: Schritt 3.2.7 ist optional. Bei Bedarf lagern Sie das endgültige Konzentrat bei 4 ° C für ~ 3 Wochen, bevor Sie zur Vesikelreinigung übergehen (Schritt 4). 4. Isolierung und Reinigung von Vesikeln Pellet direkt durch Ultrazentrifugation mit den folgenden Schritten. Die konzentrierte <0,2 μm Kulturprobe in ein sauberes Ultrazentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie bei Bedarf saubere Medien oder Puffer hinzu, um sicherzustellen, dass der Schlauch vollständig gefüllt ist.HINWEIS: Wenn die endgültige Kulturprobe zu groß ist, um in ein Röhrchen zu passen, pelletieren Sie entweder das Material in mehreren Röhrchen, um vor den Waschschritten kombiniert zu werden, oder pelletieren Sie es seriell im selben Rohr. Erstellen Sie bei Bedarf eine Waage und drehen Sie bei ~ 100.000 x g für 3 h bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Während cyanobakterielle Vesikelpellets eine gewisse Färbung aufweisen können, sind sie häufig unsichtbar. Waschen Sie das pelletierte Material, indem Sie frische Kulturmedien oder Waschpuffer wie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (siehe Diskussion) in das Ultrazentrifugenröhrchen geben, durch sanftes Pipettieren mischen und wie in Schritt 4.1.2 erneut drehen. Wiederholen Sie den Waschvorgang ein zweites Mal. Resuspendiert das letzte Pellet in frischer Kultur, indem es wiederholt, aber vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette um den Boden des Rohres herum auf und ab pipettiert wird. Transfer auf ein sauberes Schiff. Führen Sie eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch. Bereiten Sie Iodixanol-Bestände vor (siehe Materialtabelle), indem Sie eine 4-fach konzentrierte Version des für die Probe gewünschten Pufferhintergrunds erstellen (siehe Diskussion). Mischen Sie einen Teil des 4x-Puffers mit drei Teilen von 60% igem Iodixanol-Material, um eine 45% ige Iodixanol-Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 45% Iodixanol mit Volumina von 1x Puffer, um Vorräte an Gradientenmedien in 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% und 10% Endiodixanol-Konzentrationen zu erzeugen.HINWEIS: Die benötigte Gesamtmenge variiert mit der Kapazität des Ultrazentrifugenrotors / der Ultrazentrifugenrohre. Richten Sie einen Ultrazentrifugendichtegradienten ein, indem Sie vorsichtig gleiche Mengen von 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% und 0% Ioxidinol in ein Ultrazentrifugenröhrchen überlagern, so dass das gesamte Volumen des Röhrchens ausgenutzt wird.HINWEIS: Die extrazelluläre Vesikelprobe, die gereinigt werden soll, sollte als Teil der 0% igen Iodixanolschicht an die Spitze des Gradienten gelegt werden. Wenn das endgültige Volumen der Vesikelprobe die Größe der 0%-Schicht überschreitet, mischen Sie jede überschüssige Vesikelprobe mit genügend 45% Iodixanol und/oder Puffer, um das erforderliche Volumen der Optiprep-Bestände mit 10% oder höherer Konzentration zu erzeugen, und verwenden Sie diese an der entsprechenden Stelle im Gradienten. Drehen Sie den Gradienten bei ~100.000 x g bei 4 °C für 6 h. Sammeln Sie Fraktionen (typischerweise jeweils 0,5 ml für einen Gradienten von ~ 4,5 ml) durch sorgfältiges Pipettieren oder Verwenden eines Fraktionskollektors (siehe Materialtabelle). Bestimmen Sie die Dichte jeder Fraktion (in g/ml) mit einer Analysenwaage und einer kalibrierten Pipette, um das Gewicht eines bekannten Probenvolumens zu messen. Nehmen Sie die Probe aus dem Röhrchen, bestimmen Sie das Gewicht und geben Sie die Probe direkt zurück. Verdünnen Sie einzelne Fraktionen in einem neuen Ultrazentrifugenröhrchen mit sauberem Puffer und waschen Sie das Material wie in den Schritten 4.1.2-4.1.4 beschrieben. Alternativ können Sie Dialyse- oder Ultrafiltrationssäulen verwenden, um Partikel zurückzugewinnen.HINWEIS: Cyanobakterielle extrazelluläre Vesikel wandern typischerweise zu Auftriebsdichten von ~ 1,14-1,19 g / ml in Iodixanol. Lagern Sie die Vesikel bei 4 °C, wenn sie innerhalb von 1-3 Wochen verwendet werden sollen. Die Vesikel werden bei -20 °C oder -80 °C eingefroren, wenn sie länger als diesen Zeitraum nicht verwendet werden. 5. Charakterisierung der isolierten Vesikel Führen Sie eine Elektronenmikroskopie mit negativer Färbungstransmission durch (siehe Materialtabelle) (TEM; Partikelgröße, Struktur, Reinheit). Um die Bildqualität zu verbessern, entladen Glühen Sie die Oberfläche eines ehemals beschichteten TEM-Gitters mit einem Glimmentladungssystem gemäß den Richtlinien des Herstellers (siehe Materialtabelle). ~5 μL der Vesikelprobe vorsichtig auftragen und 5 min einwirken lassen.HINWEIS: Proben mit Vesikelkonzentrationen >109 ml-1 liefern in der Regel die besten Ergebnisse; mehr verdünnte Proben haben nur wenige Vesikel pro Bild. Entfernen Sie die Probe, indem Sie den Rand eines Gitters mit einem Stück sauberem Filterpapier berühren. Pipettieren Sie einen 20-50 μL Tropfen von 2% Uranylacetat (siehe Materialtabelle) auf eine flache Oberfläche, die mit Kunststofffolie bedeckt ist, und legen Sie das Gitter für 2 min schwimmend darauf. Entfernen Sie Uranylacetat mit Filterpapier und lassen Sie es kurz auf einem Tropfen Reinstwasser schwimmen, um es zu waschen. Wiederholen Sie die Wasserwäsche ein zweites Mal.HINWEIS: Das endgültige Trockengitter ist nach Schritt 5.1.5 für die Visualisierung bereit. Führen Sie ultradünne Schnittfärbungen für TEM durch (Partikelgröße, interne Struktur). Resuspendiert das Pellet aus Schritt 4.1.5 mit 1 ml 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer (pH 7) (siehe Materialtabelle) und fixiert die Probe für 2 h bei 4 °C. Drehen Sie bei ~100.000 x g für 1 h bei 4 °C. Waschen Sie das Pellet vorsichtig mit 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7) und drehen Sie es dann bei ~ 100.000 x g für 1 h bei 4 ° C. Das Pellet wird mit 1 ml 1 % Osmiumtetroxid (siehe Materialtabelle) (hergestellt in 0,1 m Natriumcacodylatpuffer) 1 Stunde lang fixiert und dann wie in Schritt 5.2.3 beschrieben waschen. Die Probe wird mit 1 ml einer aufsteigenden Reihe von Ethanol (50%, 70%, 90% und zweimal in absolutem Ethanol) in Schritten von jeweils 10 min bei 4 °C dehydriert. 250 μL Epoxidharz (siehe Materialtabelle) mit absolutem Ethanol (1:1) in das Pellet geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren. Übertragen Sie das Pellet für 24 h auf 500 μL reines Harz. Dann das Harz bei 65 °C für 48 h inkubieren.HINWEIS: Das Harz ist jetzt bereit für das Schneiden nach Ultramikrotom, gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Färben Sie die Gitter, die Abschnitte mit 2% Uranylacetat (in 50% Ethanol) enthalten, für 5 min. Waschen Sie die Objektträger vorsichtig unter fließendem deionisiertem Wasser für jeweils 10-15 s. Einen Tropfen Bleicitrat (siehe Materialtabelle) geben und für weitere 5 Minuten färben. Waschen Sie wie zuvor, entfernen Sie das Wasser, indem Sie das Gitter auf ein Filterpapier tupfen, und trocknen Sie die Gitter an der Luft. Visualisierung durch TEM nach den Richtlinien des Herstellers (siehe Materialverzeichnis). Führen Sie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durch (Partikelgröße, -konzentration). Wischen Sie mit Linsenpapier vorsichtig Staub oder sichtbares Material von der optischen Ebene ab. Überprüfen Sie, ob alle O-Ringe und andere Dichtungen sauber und intakt sind. Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie die Software. Füllen Sie die Kammer mit einer sauberen Spritze mit Reinstwasser. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Klicken Sie auf Kamera starten und visualisieren Sie den optimalen Bereich der Kammer über den “Daumenabdruck”. Stellen Sie den Mikroskoptisch je nach Bedarf horizontal oder vertikal ein, sodass die Signalintensität im gesamten Bildbereich gleichmäßig ist. Verschieben Sie den Bildbereich horizontal relativ zum Fingerabdruck (nach rechts in Richtung der vertikalen Linie), um einen Bereich in der Nähe mit niedrigem Hintergrundsignal zu finden. Schieben Sie die Schieberegler “Bildschirmverstärkung ” und ” Kameraebene ” auf das Maximum, und verringern Sie dann auf die niedrigste Stufe, um die dunkelsten Partikel anzuzeigen.HINWEIS: Typische Einstellungen für cyanobakterielle Vesikel verwenden eine Bildschirmverstärkung von 7 und eine Kamerastufe zwischen 10 und 12. Passen Sie den Fokus nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass Partikel im gesamten Sichtfeld ungefähr gleich sichtbar sind. Schieben Sie weiterhin ultrasauberes Wasser durch die Kammer, bis Sie visuell bestätigt haben, dass die Kammer sauber ist. Entfernen Sie Restwasser mit einer anderen Spritze aus der Kammer. Untersuchen Sie eine Probe des Mediums / Puffers, in dem sich Ihre Probe befindet, um die Hintergrundpartikelkonzentration zu bestimmen, indem Sie die Kammer mit Medien / Puffern mit einer sauberen 1-ml-Spritze füllen. Wählen Sie Standardmessung aus dem Dropdown-Feld SOP aus. Ändern Sie die Einstellungen, um mindestens drei technische Replikate von jeweils 60-Sekunden-Videos zu sammeln. Klicken Sie auf Skript erstellen und ausführen und folgen Sie den Anweisungen. Drücken Sie ~ 100 μL Probe in die Kammer zwischen den Replikaten. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Restpuffer mit einer Spritze, spülen Sie 3-5 ml Reinstwasser durch die Kammer und entfernen Sie das restliche Wasser. Geben Sie die Vesikelprobe mit einer 1-ml-Spritze in die Kammer und bestätigen Sie die Aufnahmeeinstellungen. Wenn die Partikelanzahl nicht im linearen Bereich des Instruments liegt (typischerweise zwischen 20-80 Partikeln / Rahmen), muss die Probe verdünnt oder konzentriert werden. Drücken Sie mindestens 500 μL Probe in die Kammer, bevor Sie Daten sammeln. Sammeln Sie Videodaten wie in Schritt 5.3.8 und stellen Sie sicher, dass die Kammer zwischen verschiedenen Proben mit Reinstwasser gereinigt wird. Sammeln Sie alle nachfolgenden Proben desselben Organismus/Experiments mit identischen Kameraeinstellungen, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen. Änderungen in der Einstellung “Kamerapegel” können sich erheblich auf die erhaltenen Endwerte auswirken. Bestimmen Sie Partikelparameter mithilfe des Analysebereichs der Software. Wählen Sie Analyse > Experiment öffnen aus, und laden Sie die Beispieldatei. Wählen Sie Ausgewählte Dateien verarbeiten aus, und warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass für alle nachfolgenden Proben aus demselben Experiment derselbe Nachweisschwellenwert verwendet wird.HINWEIS: Da cyanobakterielle Vesikel häufig dunkel sind, muss die Nachweisschwelle in der Regel auf den empfindlichsten (niedrigsten) Wert eingestellt werden. Dynamische Lichtstreuung (DLS) (Partikelgröße, Zetapotential). Filtern Sie durch einen 0,2 μm Porengrößenfilter für jede Probe, die in das DLS gelangt, um große Partikel herauszufiltern, die die Messungen stören. Geben Sie 1 ml des Mediums / Puffers in eine saubere Küvette, um mögliche Aggregationen oder andere Nanopartikel aus dem Medium zu untersuchen. Legen Sie die Küvette mit der mattierten Seite auf der linken Seite in den Mikro-Probenehmer und schließen Sie den Deckel. Lassen Sie die Probe mindestens 5 min ausgleichen. Geben Sie den Brechungsindex des Materials und die Materialaufnahme ein, wenn sie signifikant von den Standardwerten für Wasser abweichen.HINWEIS: Die Materialeigenschaften hätten nur einen sehr geringen Einfluss, wenn die Vesikel kleiner als 100 nm wären. Bei der Messung des Oberflächenpotentials (Zetapotential) von EVs sollten Vesikel in den ursprünglichen Wachstumsmedien resuspendiert werden. Klicken Sie auf Instrument Control Panel , um die Messwerte zu überprüfen und die Datenerfassung zu starten, indem Sie auf das grüne Symbol klicken. Wenn die Werte gut aussehen und Ihr Medium/Puffer keine Aggregationen oder andere Partikel enthält, können Sie jetzt Ihre Probe messen. 1 ml Vesikelprobe in eine saubere Küvette geben und Daten sammeln, wie in Schritt 5.4.4 erwähnt. Sammeln Sie mindestens drei technische Replikate für jeweils 10 Minuten. Führen Sie eine Lipopolysaccharidanalyse (LPS) durch, um zu bestätigen, dass die gramnegativen EVs in der Probe vorhanden sind. Hitzedenaturierung der Vesikelprobe bei 95 °C für 10 min im Standard 1x Laemmli Probenpuffer (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie mit 0,2 U Typ-XIV-Protease aus Streptomyces griseus (siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 30 Minuten, um kontaminierende Glykoproteine zu entfernen. Getrennte behandelte Proben durch Elektrophorese bei der Denaturierung von 16% (w/v) SDS-Polyacrylamid-Gelen gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll16. Um LPS nachzuweisen, färben Sie das Gel entweder mit handelsüblichen Färbesets oder mit einer modifizierten Silberfärbetechnik28. Quantifizieren Sie die relative LPS-Häufigkeit durch Densitometrie-Analyse von gefärbten Gelen gemäß den zuvor veröffentlichten Referenzen 29,30. 6. Messungen der Vesikelproduktionsrate Messen Sie mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse wie in Schritt 5.3 oder einer gleichwertigen Technologie die Partikelkonzentration in den Wachstumsmedien für das Experiment. Wenn eine hohe Partikelzahl gefunden wird, filtern Sie durch einen 0,1 μm Porenfilter und überprüfen Sie ihn erneut.HINWEIS: Um den Fehler zu minimieren, sollte die Medienhintergrundpartikelkonzentration weniger als 10% der Partikelkonzentration betragen, die in Kulturen mit der niedrigsten Dichte gefunden wird. Akklimatisieren Sie die Kultur, indem Sie Zellen für mindestens zwei aufeinanderfolgende serielle Transfers unter den für die Experimente gewünschten Medien- und Umgebungsbedingungen wie in Schritt 1.1.2 züchten. Kulturen müssen noch in der exponentiellen Wachstumsphase transferiert werden. Sicherstellen, dass die gemessenen Wachstumsraten der Kultur über alle Übertragungen hinweg konsistent sind; Wenn nicht, setzen Sie den Transfer von Kulturen fort, bis die Wachstumsraten reproduzierbar sind. Sammeln Sie Zeitverlaufsproben nach der Inokulation und regelmäßig zeitgesteuerte Intervalle über die Wachstumskurve bis in die frühe stationäre Phase. Die Staffelzeit weist darauf hin, dass mindestens 3-4 Proben über den gesamten Bereich des exponentiellen Wachstums gesammelt wurden. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um zu jedem Zeitpunkt ein Beispiel zu erstellen. Filtern Sie 1 ml oder mehr Kultur direkt durch einen sauberen, sterilen 0,2-μm-Spritzenfilter und speichern Sie das Filtrat, um die Vesikelkonzentration wie in Schritt 5.3 zu messen. Fixieren Sie die Zeitverlaufsproben, falls gewünscht. Verwenden Sie relative Fluoreszenz, um die Wachstumsdynamik der Kultur zu verfolgen. Speichern Sie eine Probe der gesamten Kultur, um die Populationsgröße mit einer für den Organismus geeigneten Methode zu bestimmen (Durchflusszytometrie; Kolonieplattierung; oder anderweitig). Erhalten Sie Messungen von Zellen und vesikelähnlichen Partikeln (pro ml) zu jedem Zeitpunkt. Identifizieren Sie die Zeitpunkte, die während der exponentiellen Wachstumsphase aufgetreten sind. Um r zu berechnen, die Anzahl der pro Zelle und Generation produzierten Vesikel zwischen zwei Punkten während des exponentiellen Wachstums (typischerweise Anfang und Ende des Zeitverlaufs), verwenden Sie die Gleichung in der Ergänzungsdatei 1.HINWEIS: Diese Methode ist nur unter stationären Wachstumsbedingungen gültig. Die zugrunde liegenden Annahmen und die Ableitung der Berechnung sind in Referenz14 detailliert beschrieben.

Representative Results

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über den zyanobakteriellen Vesikel-Isolationsprozess und hebt die wichtigsten Aspekte des hier beschriebenen Protokolls hervor. Besonders hervorzuheben sind die Schritte zur Trennung der cyanobakteriellen Biomasse von der Fraktion der kleinen Partikel (Vesikel), die Konzentration der Vesikelprobe und die Isolierung und Reinigung der Vesikel (Abbildung 1, Schritte 2 bis 4), die für die Gewinnung reproduzierbarer Vesikelpräparate entscheidend sind. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus der Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. Es wurde gezeigt, dass die äußere Membran dieses Cyanobakteriums Carotinoide31 enthält, die den Proben der Vesikel, die durch direkte Pelletierung durch Ultrazentrifugation gesammelt wurden, eine charakteristische orange Färbung verleihen (Abbildung 2A). Sobald das Vesikelpellet resuspendiert ist, können Vesikel mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht werden, entweder durch negatives Färben von Proben mit Uranylacetat (Abbildung 2B) oder durch Beobachtung ultradünner Schnitte (Abbildung 2C). Die Verteilung und Konzentration der Vesikelgröße kann mithilfe von dynamischer Lichtstreuung (DLS) (Abbildung 2D) und Nanopartikel-Tracking-Analysen (NTA) (Abbildung 2E) beurteilt werden. Mit dem beschriebenen Protokoll wurden typischerweise ~3,5 ± 1,0 x 108 Nanopartikel pro ml in einer exponentiell wachsenden Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 bei einem OD730 von 1,0 erhalten. Biochemische Analysen von isolierten EVs können durchgeführt werden, um die physikalische Charakterisierung der isolierten Vesikel zu ergänzen. Als Beispiel wurden gereinigte Synechocystis sp. PCC 6803 Vesikel auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel getrennt und auf Lipopolysaccharide (LPS; Abbildung 2F). Da LPS spezifisch für die äußere Membran32 sind, kann der LPS-Nachweis das Vorhandensein von membrangebundenen Vesikeln validieren und als Marker für die Analyse des relativen Vesikelgehalts zwischen Präparaten desselben Stammes33 dienen. Die Inspektion der relativen Häufigkeit von LPS mit niedrigem vs. hohem Molekulargewicht kann auf Veränderungen in der Vesikelzusammensetzung zwischen Proben34,35 hinweisen. Abbildung 1: Experimentelle Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von cyanobakteriellen EV. Schematische Darstellung von Anbaukulturen (1) und Trennung von cyanobakterieller Biomasse vom Wachstumsmedium (2). Zellfreie Proben, die Vesikel enthalten, werden konzentriert (3), und dann werden die EVs isoliert und gereinigt (4). Je nach Anwendung können Vesikelpräparate mittels einer oder einer Kombination aus Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), dynamischer Lichtstreuung (DLS) und Lipopolysaccharid-Profiling (LPS) charakterisiert werden (5). RT, Raumtemperatur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der extrazellulären Vesikelisolierung und Charakterisierung für das Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803. (A) Foto des extrazellulären Vesikelpellets (EVs-Pellet), das nach Ultrazentrifugation des konzentrierten zellfreien extrazellulären Mediums aus einer 600 ml Synechocystis sp. PCC 6803-Kultur erhalten wurde, die zu einem OD730 von 1,0-1,5 gezüchtet wurde. Beachten Sie die typische orange Färbung des Vesikelpellets, die von den Carotinoiden in der äußeren Membran abgeleitet ist. (B,C) Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen von negativ gefärbten (B) und ultradünnen Schnitten (C) von Synechocystis sp. PCC 6803 Vesikelproben. Skalenbalken: 200 nm bzw. 50 nm. Die Proben wurden auf einem Transmissionselektronenmikroskop visualisiert, das mit 80 kV betrieben wurde. (D) Typisches Diagramm der dynamischen Lichtstreuung (DLS), das die Verteilung des Vesikelvolumens als Funktion des Vesikeldurchmessers (in nm) darstellt. Farbige Linien zeigen Daten aus drei technischen Wiederholungsmessungen derselben Probe. (E) Repräsentative Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) Daten der Synechocystis extrazellulären Vesikelgrößenverteilung (in nm). Die schwarze Linie zeigt den Mittelwert von drei technischen Replikaten an, und die roten Linien stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. (F) Das Profil der Lipopolysaccharide (LPS) wurde nach der Trennung der Vesikelpräparation durch Elektrophorese auf einem 16%igen (w/v) SDS-Polyacrylamid-Gel und der Färbung mit einem handelsüblichen LPS-Färbeset nachgewiesen. LPS mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, die rauen bzw. glatten LPS-Formen entsprechen, sind nachweisbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Zusatzdatei 1: Gleichung zur Berechnung von r. Die Anzahl der Vesikel, die pro Zelle und Generation zwischen zwei Punkten während des exponentiellen Wachstums (typischerweise dem Anfang und dem Ende des Zeitverlaufs) produziert werden, wird mit dieser Gleichung bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Allgemeine Überlegungen
Das Protokoll (Abbildung 1) wird als eine Reihe von Optionen dargestellt, um hervorzuheben, dass es keine “One-Size-Fits-All” -Methode für die Arbeit mit zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln gibt. Interessierte Forscher können die Abschnitte dieses Protokolls nutzen, die für ihren jeweiligen Modellorganismus, ihre experimentellen Fragen / Ziele und die Verfügbarkeit von Geräten kompatibel und geeignet sind. Alle Ansätze der Vesikelisolierung beinhalten Kompromisse und werden unweigerlich zu einem gewissen Grad an Verzerrung führen. Während man versuchen sollte, dies nach Möglichkeit zu minimieren, besteht die wichtigste Überlegung darin, sicherzustellen, dass die verwendete detaillierte Methodik gemäß den entsprechenden MISEV-Richtlinien (Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles)36 gemeldet wird.

Kulturwachstum
Cyanobakterienkulturen können leicht aus einer der vielen weltweit verfügbaren Kultursammlungen gewonnen werden. Einige Beispiele sind die Roscoff Culture Collection (Station Biologique de Roscoff, Frankreich), die Pasteur Culture Collection (Institute Pasteur, Paris, Frankreich) und das Provasoli-Guillard National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA, Maine, USA). Der Cyanobakterienstamm der Wahl muss unter den entsprechenden Medium- und Umweltbedingungen kultiviert werden, wobei die verschiedenen Stämme erheblich variieren. Eine Liste der häufig verwendeten Medien für die Cyanobakterienkultivierung finden Sie auf den Websites der Kultursammlung oder anderen Publikationen37,38,39.

Die Arbeit mit zyanobakteriellen extrazellulären Vesikeln stellt einige einzigartige Herausforderungen im Vergleich zu den Methoden dar, die für viele typische Modelllabor-Heterotrophe berichtet wurden. Cyanobakterienkulturen haben Vesikelkonzentrationen von Größenordnungen, die niedriger sind als bei anderen Mikroben wie Escherichia coli14,16,40. Diese Unterschiede, die sich vermutlich aus niedrigeren Zelldichten und/oder Vesikelproduktionsraten ergeben, bedeuten, dass relativ große Kulturen (~ 1-20 L oder mehr) erforderlich sein können, um ausreichend Material für Bulk-Analysen zu liefern. Daher werden die Forscher ermutigt, die Vesikelausbeuten aus kleineren Kulturen zu testen, um zu bestimmen, wie viel Material notwendig ist, um ihre gewünschten Endziele zu erreichen. Die Wichtigkeit der Feststellung, ob die für das Experiment verwendeten Medien einen nachweisbaren Partikelhintergrund haben, muss vor Beginn eines Experiments ebenfalls betont werden, da dieses Material möglicherweise die Quantifizierung der Vesikelpopulation verwirren, die Empfindlichkeit von Messungen der Vesikelkonzentration / -größe verringern oder die endgültigen Vesikelpräparate kontaminieren kann.

Eine weitere Herausforderung für das Feld besteht darin, dass nicht alle Cyanobakterien in Reinkultur gut oder überhaupt nicht wachsen. Interpretationen von physikalischen Vesikeleigenschaften, Produktionsraten oder -inhalten können nicht notwendigerweise zu klaren Schlussfolgerungen über Vesikel führen, die von einem einzelnen Stamm in der Gemeinschaft produziert werden. Den Forschern wird auch empfohlen, zu überlegen, welche anderen Arten von Partikeln vorhanden sein und möglicherweise mit Vesikeln durch spezifische Nanopartikel-Analysewerkzeuge verwechselt werden könnten, die nicht unbedingt zwischen verschiedenen Partikeltypen unterscheiden können. Zum Beispiel kann es wichtig sein, zu überprüfen, ob dem verwendeten Stamm eine Prophage fehlt, entweder durch Genomsequenzierung, Induktionsassays oder andere Mittel, oder andere Arten von Feinstaub freisetzt. Nach unserer Erfahrung haben die meisten Cyanobakterienvesikel einen Durchmesser von <0,2 μm, aber wenn man einen neuen Stamm oder eine neue Wachstumsbedingung betrachtet, sollte man bestätigen, ob die Verwendung eines 0,45 μm Porenfilters die Größenverteilung von gereinigten Partikeln verändert.

Viele Aspekte der Kulturbedingungen können die Vesikelproduktion und ihren Inhalt beeinflussen41,42. Daher müssen die physikalischen und chemischen Bedingungen, die für das Kulturwachstum verwendet werden (einschließlich Lichtbestrahlungsstärke, Temperatur und Medienzusammensetzung), so weit wie möglich dokumentiert und kontrolliert werden, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Jede chemische Analyse des Vesikelgehalts muss die Hintergrundzusammensetzung berücksichtigen, insbesondere bei der Durchführung von Hochdurchsatzanalysen im Stil von “-omics”. Dies kann besonders kritisch sein, wenn undefinierte Medien verwendet werden, z. B. solche, die auf einem natürlichen Meerwasserhintergrund basieren oder mit Hefeextrakt oder Trypton ergänzt werden. Die Verwendung eines definierten Wachstumsmediums kann je nach den experimentellen Zielen vorzuziehen sein.

Die Forscher müssen die Wachstumsdynamik der Kultur in regelmäßigen Abständen sorgfältig überwachen, um sicherzustellen, dass sie wissen, wo sich in der Wachstumsphase eine bestimmte Batch-Kultur befindet, und nicht nur nach einer beliebigen Zeit Proben sammeln. Die Vesikelzusammensetzung kann über Wachstumsphasen variieren, insbesondere zwischen exponentiellen und stationären Phasen41,42. Zum Beispiel kann zumindest ein Teil der Vesikel, die in der stationären Phase beprobt werden, aus einem anderen zellulären Mechanismus wie der Zelllyse entstehen, der während des exponentiellen Wachstums nicht auftreten wird. Während dies immer noch von großem biologischem Interesse sein kann, ist es wichtig, die Probe zu kennen. Wenn eine Cyanobakterienkultur die gewünschte Wachstumsphase zu einem Zeitpunkt erreicht, zu dem es nicht möglich ist, direkt zur Probenkonzentration überzugehen, wird empfohlen, die Zellen sofort von der <0,2 μm-Fraktion zu trennen (mit Zentrifugation und/oder direkter 0,2-μm-Filtration) und dann das zellfreie Filtrat bei 4 °C zu lagern. Das Material kann auf diese Weise tagelang gelagert werden, ohne dass ein Einfluss auf die Konzentration oder Größenverteilung von Vesikeln spürbar ist.

Vesikelreinigungen
Die häufige Notwendigkeit, Vesikel aus signifikanten Volumenkulturen zu isolieren, ist im Arbeitsablauf der zyanobakteriellen Vesikelisolierung von entscheidender Bedeutung. Bei der Arbeit mit größeren Materialmengen müssen die Vesikel vor nachgelagerten Trennabläufen konzentriert werden. Generell wird empfohlen, Konzentratoren (Tangentialströmungsfiltermembranen oder Zentrifugalsäulen) mit einer Nennmolekulargewichtsgrenze von 100 kDa zu empfehlen, da sie eine Abscheidung von löslichem Material mit niedrigem Molekulargewicht unter vernünftigen Konzentrationszeiten ermöglichen, aber auch 30 kDa Filter werden häufig mit Erfolg eingesetzt. Während mehrere nicht-ultrazentrifugationsbasierte Methoden zur Reinigung von Vesikeln (z. B. Größenausschlusschromatographie, mikrofluidikbasierte Systeme, Affinitätserfassungstechniken und fällungsbasierte Ansätze) im extrazellulären Vesikelfeld immer beliebter werden, können diese Ansätze unserer Erfahrung nach zu geringeren Erträgen führen und sind typischerweise nicht mit den benötigten Kulturvolumina kompatibel.

Die Forscher müssen die Zusammensetzung des Iodixanol-Hintergrunds und der Wasch- / Resuspensionspuffer, die während der Vesikelreinigung verwendet werden, berücksichtigen, um sicherzustellen, dass sie mit den gewünschten nachgelagerten Anwendungen kompatibel sind. In vielen Fällen kann die endgültige Vesikelprobe in Wachstumsmedien oder einem definierten Puffer resuspendiert werden, der in seiner Zusammensetzung mit dem Wachstumsmedium vergleichbar ist (z. B. natürliches vs. künstliches Meerwasser). Dies ist jedoch möglicherweise nicht möglich mit marinen Cyanobakterienvesikeln, die eine weitere experimentelle Manipulation für die Analyse erfordern, da hohe Salzkonzentrationen, die dem Meerwasserspiegel ähneln, viele enzymatische Reaktionen hemmen können. In solchen Fällen funktionieren Standard-Laborpuffer wie 0,2 μm gefiltert, 1x PBS typischerweise gut für die Aufrechterhaltung der Stabilität mariner Cyanobakterienvesikel und können besser mit nachgelagerten experimentellen Prozessen kompatibel sein.

Die Dichtegradientenreinigung kann je nach experimentellen Zielen und Kulturzusammensetzung als optional angesehen werden, wird jedoch dringend empfohlen, um eine strenger reine und reproduzierbare Probe herzustellen. EV-Populationen sind heterogen und können in einer Reihe von Auftriebsdichten gefunden werden, die je nach Stamm, Wachstumsbedingungen und anderen Faktoren weiter variieren 4,5,6. Die oben aufgeführten Dichten repräsentieren diejenigen, die typischerweise für Vesikel aus Cyanobakterienkulturen und Feldproben in Iodixanol gefunden werden, aber die Ergebnisse zu anderen Stämmen können variieren. Andere Dichtegradientenmaterialien wie Saccharose und CsCl können für Vesikel verwendet werden, aber sie wandern zu unterschiedlichen Auftriebsdichten in diesen Hintergründen. Verschiedene Gradientenmedienhintergründe können die Erholung von lipidumschlossenen Viren43 verzerren und möglicherweise die Erholung von Vesikeln aus verschiedenen Stämmen beeinflussen.

Durch den hier beschriebenen Vesikelisolations- und Gradientenreinigungsprozess können Vesikel an mehreren Stellen verloren gehen, wodurch die Ausbeute reduziert und die Menge an Ausgangsmaterial erhöht wird, die benötigt wird, um eine bestimmte endgültige Vesikelausbeute für nachgelagerte Anwendungen zu erreichen. Besondere Vorsicht ist bei der Arbeit mit Vesikelpellets nach der Ultrazentrifugation geboten. Während einige cyanobakterielle Vesikel Carotinoide oder andere Verbindungen aufweisen können, die den Vesikelproben eine gewisse Pigmentierung verleihen können (Abbildung 2), wird je nach Stamm oder Materialmenge nicht unbedingt erwartet, dass sie in der Lage sind, das Vesikelpellet direkt zu visualisieren. Achten Sie darauf, wo das Pellet voraussichtlich die Art des verwendeten Zentrifugenrotors erhalten wird. Wenn möglich, wird empfohlen, gereinigte Vesikelproben elektronenmikroskopisch zu untersuchen, um die Zusammensetzung des endgültigen gewonnenen Materials zu überprüfen.

Der Einfluss der Lagerbedingungen auf Vesikel und deren Inhalt bleibt eine offene Frage. Obwohl festgestellt wird, dass die Lagerung keinen nennenswerten Einfluss auf die Größe oder Konzentration von Cyanobakterienvesikelnhat 14, kann sich die Funktionalität isolierter Vesikelpräparate im Laufe der Zeitändern 44. Während Frost-Tau-Zyklen nach Möglichkeit vermieden werden sollten, scheinen die Auswirkungen des Einfrierens von Proben auf die Gesamtanzahl und -größe der Vesikel minimal zu sein. Man sollte sich des Potenzials von Gefrier-Tau-Zyklen bewusst sein, die Zusammensetzung des Vesikelgehalts zu beeinflussen, wie z.B. die Länge von Vesikel-assoziierten Nukleinsäuren oder die Stabilität von Proteinen.

Vesikel aus Mitteln
Aktuelle Methoden zur Isolierung extrazellulärer Vesikel aus natürlichen aquatischen Umgebungen ähneln konzeptionell und operativ denen, die hier für großvolumige Kulturen beschrieben werden. Dennoch können sie noch größere Mengen an Material benötigen. Solche Feldproben können die Entnahme, Filtration und Konzentration von Hunderten bis Tausenden von Litern Wasser umfassen, um ausreichend Material für die Analyse zu erhalten. Abhängig von der Trübung der verwendeten Probe kann der Einbau eines oder mehrerer Vorfiltrationsschritte vor dem 0,2-μm-Filter erforderlich sein. Das speziell verwendete TFF-Gerät sollte geeignet sein, mit so großen Volumina in angemessener Zeit (idealerweise in der Größenordnung von Stunden) und ohne übermäßigen Druck auf die Probe zu arbeiten. In der Praxis beinhaltet dies häufig die Verwendung einer viel größeren Gesamtoberfläche als bei kulturbasierten Proben sowie von Schläuchen mit größerem Durchmesser, um erhöhte Durchflussraten zu ermöglichen. Diese vergrößerte Filteroberfläche wird wahrscheinlich zu einem geringfügigen Anstieg der Partikelverluste im Vergleich zu kleineren TFF-Anordnungen und einem größeren Endvolumen an Konzentrat führen; Diese Bedenken müssen jedoch mit Überlegungen zur Gesamtbearbeitungszeit abgewogen werden. Für Situationen wie eine ausgedehnte ozeanographische Kreuzfahrt, bei der die Proben viele Tage nach der Probenahme nicht in ein Labor zurückkehren, empfehlen wir die Durchführung einer anfänglichen 0,2-μm-Filtration und TFF-Schritten im Feld. Dieses kleinere Volumen an konzentriertem Material kann dann bei 4 ° C oder -80 ° C an Bord gelagert werden (abhängig von der Verfügbarkeit und den nachgelagerten analytischen Überlegungen), bis es zur endgültigen Verarbeitung an das Labor zurückgegeben wird.

Die Isolierung und Trennung von extrazellulären Vesikeln von anderen kleinen Partikeln, sowohl organischen als auch anorganischen, kann eine Herausforderung darstellen, und die Methoden zur Trennung verschiedener Partikel sind noch nicht perfekt. Zum Beispiel können Iodixanol-Dichtegradienten nicht ohne weiteres alle Klassen von Vesikeln und Viren trennen, die in einer bestimmten Probe vorhanden sind. Da die Arten von Störteilchen und ihre physikalischen Eigenschaften zwischen den Probenahmestellen variieren, ist es derzeit unmöglich, ein Protokoll bereitzustellen, das alle Klassen kleiner aquatischer Partikel robust partitioniert. Versuch und Irrtum sind unerlässlich, und Experimente mit dem Iodixanol-Bereich, der unter den Gradienten- und Ultrazentrifugationsbedingungen verwendet wird, sind erforderlich, um die Trennung zu maximieren. Eine Sammlung kleinerer, feiner aufgelöster Dichtefraktionen kann ebenfalls erforderlich sein. Je nach Kontext kann die Verwendung von CsCl-Gradienten anstelle von Iodixanol dazu beitragen, Umweltpartikelzu trennen 45. Dennoch könnte die Veränderung der osmotischen Bedingungen zu Verzerrungen bei den endgültigen Rückgewonnenen Produkten führen, wie oben diskutiert.

Charakterisierung der Vesikel
Nanopartikel-Analysegeräte sind in mikrobiologischen Laborumgebungen noch nicht routinemäßig verfügbar, werden aber zunehmend verfügbar. Alle Methoden haben Vor- und Nachteile, und wir machen keine spezifische Billigung einer Plattform als besser als alle anderen für cyanobakterielle Vesikelarbeit; In der Tat haben alle besondere Kompromisse in Bezug auf Kosten, Auflösung, Benutzerfreundlichkeit, Nachweisgrenzen, Kompatibilität mit verschiedenen Wachstumsmedien / Pufferhintergründen und Datenreproduzierbarkeit. Zusätzlich zu den Instrumenten, die auf der oben beschriebenen Nanopartikel-Tracking-Analyse basieren, können andere Ansätze, einschließlich der Nanoflow-Zytometrie, der mikrofluidischen resistiven Pulserkennung und der abstimmbaren resistiven Pulsmessung, angewendetwerden 46,47. Benutzer sollten darauf achten, die Details ihrer verfügbaren Instrumentierung zu erfahren und sicherzustellen, dass sie gut mit ihrem System funktioniert, da wir bei der Verwendung einiger Plattformen mit meerwasserbasierten Medien auf Schwierigkeiten gestoßen sind. Wir ermutigen das Feld, sich in Richtung quantitativer Charakterisierung der Vesikelgröße, -konzentrationen und -produktionsraten zu bewegen. Die Messung der Vesikelkonzentrationen auf einer fundamentalen Partikel-pro-ml-Basis und nicht in Bezug auf den Proteingehalt oder andere Metriken wird die Integration von Vesikeln in quantitativere Rahmenbedingungen ermöglichen und Vergleiche zwischen Stämmen und Bedingungen ermöglichen. Weitere Anstrengungen zur Verbesserung der Fähigkeit zur Kalibrierung von Konzentrationsmessungen für <100nm-Partikel sind erforderlich.

Die Tatsache, dass Messungen der Vesikelproduktionsrate direkt aus einem 0,2 μm gefilterten Kulturüberstand durchgeführt werden, um Partikelverluste zu minimieren, wäre mit anderen oben beschriebenen Reinigungsschritten verbunden. Dies bedeutet jedoch, dass der Ansatz nicht unbedingt zwischen tatsächlichen extrazellulären Vesikeln und anderen kleinen Partikeln in den Kulturen unterscheidet. Nur das Zählen von Partikeln innerhalb bestimmter Größenbereiche (z. B. 50-250 nm Durchmesser) kann dazu beitragen, einige Ausreißer auszuschließen, aber eine visuelle Bestätigung, dass pelletierte <0,2 μm Kulturgehalte membrangebundene Vesikel zu sein scheinen (durch TEM oder andere Ansätze), ist erforderlich, um spezifisch behaupten zu können, dass man die Produktion von Vesikeln im Gegensatz zur Produktion von vesikelähnlichen Partikeln misst.

Ein wesentlicher Faktor bei der Vesikelcharakterisierung ist es, sicherzustellen, dass die Vesikelprobe im entsprechenden linearen Empfindlichkeitsbereich des Nanopartikel-Analysegeräts analysiert wird. Wenn eine Probe zu konzentriert ist, ist es einfach, dieses Material mit einem sauberen Puffer zu verdünnen und erneut zu analysieren. Auf der anderen Seite kann die relativ geringe Zell- und/oder Vesikeldichte einiger Cyanobakterienkulturen manchmal zu Vesikelpräparaten führen, die unterhalb der Nachweisgrenzen einiger Instrumente liegen. In Fällen, in denen dies bei der Reinigung von Bulk-Vesikeln der Fall ist, kann in Betracht gezogen werden, Kulturen mit größerem Volumen anzubauen, das Endmaterial in einem kleineren Volumen erneut zu pelletieren und zu suspendieren oder zu bewerten, ob es einen Schritt im Isolationsprozess gibt, bei dem übermäßige Verluste auftreten und gemildert werden könnten. Bei der Messung der Vesikelproduktionsraten sind die Korrekturen nicht unbedingt so einfach. Proben können bei Bedarf konzentriert werden, aber die erste sollte sehen, ob Anpassungen der Medien zu höheren Zelldichten führen könnten oder ob ausreichend konzentrierte Proben aus späteren Zeitpunkten während der exponentiellen Phase erhalten werden könnten, in der die Konzentrationen höher sein werden.

Begrenzungen
Wie bei jedem Protokoll hat die Vesikelisolierung mit diesen Ansätzen klare Einschränkungen. Diese Ansätze stützen sich nicht auf ihre Garantie, dass eine völlig reine Vorbereitung von Vesikeln isoliert wird. Sowohl Kulturen als auch Feldproben können andere Materialien enthalten, die ähnlich wie Vesikel in Dichtegradienten wandern. Dennoch sind zumindest diese Arten von zusätzlichen Reinigungsmethoden unerlässlich, um die Strenge und Reproduzierbarkeit der Vesikelanalyse zu gewährleisten. Während wir Vesikelisolationsansätze im Zusammenhang mit Cyanobakterien beschreiben, werden Kulturen vieler anderer Mikroben auch Vesikel in vergleichsweise geringen Konzentrationen enthalten, und die hier beschriebenen Verfahren sollten allgemein anwendbar sein. Es wird erwartet, dass diese Methoden nicht als dauerhaftes Protokoll dienen werden, sondern als Ausgangspunkt, um zukünftige Fortschritte bei der Arbeit mit extrazellulären Vesikeln aus verschiedenen Mikroben voranzutreiben. Zukünftige Anstrengungen sind erforderlich, um diese Methoden mit anderen Ansätzen wie Größenausschlusssäulen oder asymmetrischer Feldflussfraktionierung zu kombinieren, um die Unterscheidung und Trennung verschiedener Kategorien kleiner Partikel aus Kulturen und Umweltproben zu verbessern. Wir hoffen auch, dass sich diese Techniken neben Verbesserungen der Nanopartikelcharakterisierungstechnologien weiterentwickeln können, um die Fähigkeit zu verbessern, die Heterogenität innerhalb von Vesikelpopulationen, ihren Inhalt und ihre genauen funktionellen Rollen in der Umwelt zu untersuchen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren würdigen die Unterstützung der i3S Scientific Platforms “Biointerfaces and Nanotechnology” und “Histology and Electron Microscopy”, einem Mitglied der nationalen Infrastruktur Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122). Wir danken auch Prof. J. A. Gonzalez-Reyes (Universität Córdoba, Spanien) für die Unterstützung bei der Optimierung des ultradünnen Abschnittsfärbeprotokolls für TEM und Dr. Cecília Durães und Dr. Ana Rita Pinto (Universität Porto, Portugal) für die Nanopartikel-Tracking-Analyse.

Diese Arbeit wurde von der US National Science Foundation (OCE-2049004 an SJB), von Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) Mitteln durch das COMPETE 2020 Operacional Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal, 2020, und aus portugiesischen Mitteln durch Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior im Rahmen des Projekts POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO) finanziert. Fundação para a Ciência e a Tecnologia ist auch für das PhD-Stipendium SFRH/BD/130478/2017 (SL) und das FCT Investigator Grant IF/00256/2015 (PO) hoch anerkannt. M.C.M.-M. wurde durch ein Marie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (Reintegration Panel) innerhalb des Horizon 2020 Rahmenprogramms (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) unterstützt.

Materials

1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer — Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining – TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium — Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections – TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections – TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections – TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium — Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium — Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections – TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument
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Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).
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