ミトコンドリア機能障害を研究するための インビトロ アプローチ:サイブリッドモデル
Summary
トランスミトコンドリア・シブリッドは、ミトコンドリアDNA(mtDNA)枯渇細胞(rho0 細胞)と、ミトコンドリア障害に罹患した患者由来の細胞プラスト(除核細胞)とを融合させたハイブリッド細胞である。それらは、疾患の核またはミトコンドリア起源の決定、生化学的活性の評価、およびmtDNA関連変異体の病原性役割の確認を可能にする。
Abstract
酸化的リン酸化(OXPHOS)を行うミトコンドリア呼吸鎖複合体の欠損は、ヒトミトコンドリア障害の生化学的マーカーである。遺伝的観点から見ると、OXPHOSは、核DNA(nDNA)とミトコンドリアDNA(mtDNA)の2つの異なる遺伝子系の相補から生じるため、ユニークな例を表しています。したがって、OXPHOS欠損は、核およびミトコンドリアにコードされる遺伝子に影響を及ぼす変異に起因する可能性がある。
1989年に発表されたKingとAttardiによる画期的な研究は、mtDNA(rho0と名付けられた)を枯渇させたヒト細胞株が、いわゆる「トランスミトコンドリアサイブリッド」を得るために外因性ミトコンドリアによって再移入され得ることを示した。これらのシブリッドは、ミトコンドリア障害患者由来のミトコンドリア(MDs)とrho0 細胞由来の核を含むため、欠損がmtDNA関連かnDNA関連かを検証することができる。これらのサイブリッドはまた、突然変異の病原性を検証し、生化学的レベルでその影響を研究するための強力なツールです。この論文では、サイブリッドの生成、選択、および特性評価を記述する詳細なプロトコルを提示する。
Introduction
ミトコンドリア障害(MD)は、核(nDNA)またはミトコンドリア(mtDNA)DNAのいずれかの変異によるミトコンドリア機能の障害によって引き起こされる多系統症候群のグループである1。それらは最も一般的な遺伝性代謝疾患の1つであり、有病率は1:5,000である。mtDNA関連疾患は、ミトコンドリア遺伝学の規則に従う:母体遺伝、ヘテロプラスミーおよび閾値効果、および有糸分裂分離2。ヒトmtDNAは16.6 kbの二本鎖DNA円であり、複製および転写に必要な配列を有する短い制御領域、13のタンパク質コード遺伝子(呼吸鎖のすべてのサブユニット)、22のtRNA、および2つのrRNA遺伝子3を含む。
健常者では、単一のmtDNA遺伝子型(ホモプラスミー)が存在するが、病理学的状態においては複数の遺伝子型が共存(ヘテロプラスミー)する。有害な異質体変異は、OXPHOSを破壊し、任意の年齢で任意の臓器に影響を与える可能性のある疾患を引き起こすために、臨界閾値を克服しなければならない4.OXPHOSの二重遺伝学は遺伝を指示する:常染色体劣性または優性およびX連鎖性nDNA変異の場合、母体性はmtDNA変異の場合、および散発的な症例はnDNAおよびmtDNAの両方である。
ミトコンドリア医学時代の初めに、キングとアタルディ5による画期的な実験は、mtDNAが完全に枯渇した腫瘍細胞株(rho0細胞)とMD患者からのミトコンドリアからの核を含むハイブリッド細胞を作成することによって、MDの原因となる突然変異の起源を理解するための基礎を確立しました。 そして、核ゲノムまたはミトコンドリアゲノムに変異が存在するかどうかを判断することは容易ではなかった。1989年に記載されたこの方法は、その後、ミトコンドリア医学の分野で働くいくつかの研究者によって使用されました6,7,8,9;詳細なプロトコルが最近公開されました10, しかし、ビデオはまだ作られていません.NGSが突然変異がどこにあるかを正確かつ迅速に特定できるのに、なぜそのようなプロトコルが今日関連しているのでしょうか?その答えは、サイブリッド生成が、新規mtDNA変異の病原性役割を理解し、ヘテロプラスミーの割合を疾患の重症度と相関させ、患者の自生核バックグラウンドの寄与が存在しない均質核系において生化学的調査を行うための最先端のプロトコルである11、12,13。
このプロトコールは、35mmペトリ皿中で増殖したコンフルエントな患者由来の線維芽細胞から細胞プラストを得る方法を記載している。サイトカラシンBの存在下でのディッシュの遠心分離は、除核サイトプラストの単離を可能にし、次いで、ポリエチレングリコール(PEG)の存在下でrho0 細胞と融合させる。得られたシブリッドは、クローンが発生するまで選択培地で培養される。代表的な結果のセクションは、mtDNAがドナー患者の線維芽細胞のそれと同一であり、nDNAが腫瘍性rho0 細胞株の核DNAと同一であることを証明するために、得られたシブリッドの分子特性評価の例を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
mtDNAは、保護ヒストンの欠如および呼吸鎖に近いその位置のためにnDNAと比較して非常に高い突然変異率を有し、これは修復系16によって効率的に打ち消されない有害な酸化効果に分子をさらす。最初の病原性mtDNA変異は1988年17、18年に同定され、それ以来、多数の変異が記載されている。NGS技術は、ミトコンドリアゲノム全体をス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、マリアニ財団の資金提供を受けたミトコンドリア小児疾患研究センター(http://www.mitopedia.org)で実施されました。VTは、希少神経筋疾患のための欧州参照ネットワーク(ERN EURO-NMD)のメンバーです。
Materials
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | Sigma-Aldrich (Merck) | B5002-500MG | |
| 6 well Plates | Corning | 3516 | |
| 96 well Plates | Corning | 3596 | |
| Blood and Cell Culture DNA extraction kit | QIAGEN | 13323 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | 7,200 rcf, 37 °C |
| Centrifuge bottles, 250 mL | Beckman Coulter | 356011 | |
| Cytochalasin B from Drechslera dematioidea | Sigma-Aldrich (Merck) | C2743-200UL | |
| Dialyzed FBS | Gibco | 26400-036 100mL | |
| DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate) | EuroClone | ECB7501L | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline – PBS (w/o Calcium w/o Magnesium) | EuroClone | ECB4004L | |
| Ethanol Absolute Anhydrous | Carlo Erba | 414601 | |
| FetalClone III (Bovine Serum Product) | Cytiva – HyClone Laboratories | SH30109.03 | |
| Glass pasteur pipettes | VWR | M4150NO250SP4 | |
| Inverted Research Microscope For Live Cell Microscopy | Nikon | ECLIPSE TE200 | |
| JA-14 Fixed-Angle Aluminum Rotor | Beckman Coulter | 339247 | |
| Laboratory autoclave Vapormatic 770 | Labotech | 29960014 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | EuroClone | ECB 3000D | |
| Minimum Essential Medium MEM | Euroclone | ECB2071L | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| PEG (Polyethylene glicol solution) | Sigma-Aldrich (Merck) | P7181-5X5ML | |
| Penicillin-Streptomycin (solution 100x) | EuroClone | ECB3001D | |
| Primo TC Dishes 100 mm | EuroClone | ET2100 | |
| Primo TC Dishes 35 mm | EuroClone | ET2035 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | EuroClone | ECM0542D | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Trypsin 2.5% in HBSS | EuroClone | ECB3051D | |
| Uridine | Sigma-Aldrich (Merck) | U3003-5G |
References
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