해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩
Summary
이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.
Abstract
골지 함침은 사소한 적응과 골지 염색 키트를 사용하여 쥐 해마와 내측 전두엽 피질에 수지상 척추를 함침시키는 데 사용됩니다. 이 기술은 사전 혼합 된 화학 물질이 사용하기에 더 안전하고, 뉴런이 일관되게 잘 함침되고, 배경 파편이 훨씬 적고, 주어진 영역에 대해 실험 사이에 척추 밀도의 편차가 극히 적기 때문에 골지 함침의 이전 방법에 비해 눈에 띄는 개선입니다. 또한, 뇌는 특정 시점 이후에 축적 될 수 있으며 추가 처리 될 때까지 얼어 붙을 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 관심있는 모든 뇌 영역을 연구 할 수 있습니다. 일단 염색되고 뚜껑이 미끄러지면, 수지상 척추 밀도는 덴드라이트 길이에 대한 척추의 수를 계산하여 결정되고 10 μm 덴드라이트 당 척추 밀도로 표현된다.
Introduction
뉴런을 표지하기 위해 칼륨 디크로메이트와 질산은을 사용하는 방법은 Camillo Golgi1,2에 의해 처음 기술되었으며, 이후 산티아고 라몬 y Cajal에 의해 뉴런과 아교 아형을 구별하는 엄청난 양의 작업을 생성하는 데 사용되었습니다. 그의 삽화와 함께 최근에 출판 된 책을 지금 사용할 수 있습니다3. 100여 년 전에 출판된 라몬 이 카잘(Ramon y Cajal)의 연구에 따르면, 골지 함침은 거의 사용되지 않았다. 골지 함침은 광학 현미경으로 뉴런의 입체 시각화를 가능하게하는 힘든 과정입니다. 수년에 걸쳐 골지 방법의 수많은 변형이 있었고, 그 방법이 더 쉽고 염색이 더 일관되게 이루어지도록4. 1984년, Gabbott과 Somogyi5는 보다 신속한 처리를 가능하게 하는 단일 섹션 골지 함침 절차를 기술했다. 이 골지 함침 방법은 4 % 파라 포름 알데히드와 1.5 % 피크르산으로 관류해야하며, 고정 후 3 % 칼륨 디크로메이트의 욕조로 비브라 톰을 절편해야합니다. 섹션은 유리 슬라이드에 장착되며, 커버 슬립의 네 모서리는 질산은에 담그면 확산이 점진적으로 진행되도록 접착됩니다. 그런 다음 커버 슬립이 튀어 나오고 섹션이 탈수되고 결국 장착 매체로 영구적으로 미끄러 져 덮습니다. 이 기술은 해마에서 뉴런과 글리아 6,7,8을 라벨링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 설명 된 신속한 골지 방법은 칼륨 디크로메이트와 질산은 모두에 대한 노출이 훨씬 적고 파라포름 알데히드와 피크르산이 사용되지 않기 때문에 개선되었습니다. 또한, Gabbott 및 Somogyi5 방법의 변형을 사용하여 함침시킨 세포를 분석 할 수 있었지만, 종종 탈수 단계 동안 섹션이 과다 또는 과소 노출되거나 슬라이드에서 떨어졌으며 일반적으로 분석을 위해 충분한 세포를 갖도록 여러 실험을 풀링해야했습니다.
본 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질 (mPFC)에서 수지상 및 수지상 척추를 표지하기 위해 골지 염색 키트 (물질의 표 참조)의 사용을 기술한다. 이전 방법보다이 방법의 장점은 빠르고, 연구원에게 유해한 화학 물질에 덜 노출되며 뉴런의 일관된 염색이 있다는 것입니다. 아래에 기술된 프로토콜은 많은 연구에서 래트의 해마 및 mPFC에서 수지상 척추 밀도를 평가하기 위해 사소한 변형과 함께 사용되어 왔으며 많은 연구 9,10,11,12,13,14,15에서 사용되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 많은 섹션들의 신속한 동시 처리를 가능하게 하는 골지 함침의 방법을 기술한다. 이전에 설명한5 가지 노동 집약적 인 방법에 비해 개선되었으며 분석을 위해 함침 된 뉴런을 지속적으로 산출합니다. 또한, 골지 함침에 사용되는 독성 화학 물질에 대한 노출이 적습니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 슬라이드에서 섹션을 평평하게 만드는 것이므로 상당한 연습…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants의 지원을 받았습니다.
Materials
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. . The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , 208 (2017).
- Dall’Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The ‘single’ section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
