Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen

Mitochondriale Dysfunktion wurde mit mehreren neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Huntington-Krankheit und ^{Alzheimer-Krankheit 1,2,3}. PD-Modelle wie PINK1 Knockout (KO) Mäuse und Ratten zeigen eine beeinträchtigte mitochondriale Funktion 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondrien, die aus dem Striatum (STR) oder dem ganzen Gehirn der gealterten PINK1 KO-Maus isoliert wurden, weisen Defekte im Komplex I 7,10,12,13 auf. Die direkte Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist eine der gebräuchlichsten Methoden zur Bewertung der mitochondrialen Funktion, da die OCR mit der ATP-Produktion, der Hauptfunktion der Mitochondrien¹⁴, gekoppelt ist. Daher kann die Messung der OCR in Krankheitsmodellen oder von Patienten abgeleiteten Proben / Geweben helfen zu untersuchen, wie mitochondriale Dysfunktion zu Krankheiten führt.

Derzeit gibt es mehrere Möglichkeiten, die mitochondriale OCR zu messen, einschließlich der Clark-Elektrode und anderer O2-Elektroden, des_{O2-Fluoreszenzfarbstoffs} und des extrazellulären Flussanalysators 15,16,17,18,19. Als Vorteil ermöglichen O2-Elektroden-basierte Verfahren die einfache Zugabe verschiedener Substrate. Sie reichen jedoch nicht aus, um mehrere Proben gleichzeitig zu messen. Im Vergleich zu herkömmlichen O2-Elektroden-basierten Methoden bietet der extrazelluläre Flussanalysator, ein häufig verwendetes Werkzeug für OCR in Zellkulturen oder gereinigten Mitochondrien, einen verbesserten Durchsatz^15,18,20. Dennoch werden alle diese Methoden in der Regel angewendet, um OCR in isolierten Mitochondrien oder Zellkulturen 6,16,17,19,20,21 zu messen. Die Isolierung von Mitochondrien verursacht unbeabsichtigte Schäden, und extrahierte Mitochondrien oder Zellkulturen sind physiologisch weniger relevant als intakte Hirnschnitte²². Selbst wenn Mikroelektroden in Schnitten verwendet werden, sind sie weniger empfindlich und schwieriger zu bedienen als in kultivierten Zellen²³.

Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir mit dem XF24 extrazellulären Flussanalysator eine Methode entwickelt, die die Analyse mehrerer Stoffwechselparameter aus akuten striatalen Hirnschnitten von Mäusen²⁴ ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche direkte Quantifizierung der mitochondrialen Atmung über die OCR. Kurz gesagt, kleine Abschnitte von striatalen Hirnschnitten werden in Vertiefungen der Inselplatte platziert, und der Analysator verwendet Sauerstoff- und Protonenfluoreszenz-basierte Biosensoren, um die OCR und die extrazelluläre Versauerungsrate zu messen, bzw. 17,21,25.

Eines der einzigartigen Merkmale des Analysators sind die vier Injektionsquellen, die die kontinuierliche Messung der OCR ermöglichen, während nacheinander bis zu vier Verbindungen oder Reagenzien injiziert werden; Dies ermöglicht die Messung mehrerer zellulärer Atmungsparameter, wie z. B. basale mitochondriale OCR, ATP-verknüpfte OCR und maximale mitochondriale OCR. Die Verbindungen, die während der Messungen für das hier gezeigte Protokoll injiziert wurden, waren Arbeitskonzentrationen von 10 mM Pyruvat in der ersten Lösungsvertiefung (Port A), 20 μM Oligomycin in der zweiten Lösungsvertiefung (Port B), 10 μM Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy) Phenylhydrazon (FCCP) in der dritten Vertiefung (Port C) und 20 μM Antimycin A in der vierten Vertiefung (Port D), basierend auf Fried et ^al.25. Es muss beachtet werden, dass diese Konzentrationen Arbeitskonzentrationen waren, und Stammlösungen von 10x, 11x, 12x und 13x wurden in die Lösungsports A bis D injiziert. Der Zweck der Verwendung jeder Lösung war wie folgt: 1) Pyruvat war notwendig, da ohne es die Zugabe von FCCP eine verringerte OCR-Reaktion hätte, die durch eine Einschränkung der verfügbaren Substrate verursacht wurde; 2) Oligomycin hemmt die ATP-Synthase und ermöglicht die Messung der ATP-verknüpften Atmung; 3) FCCP entkoppelt die Oxidation von der Phosphorylierung und ermöglicht die Messung der maximalen mitochondrialen Kapazität; 4) Antimycin A hemmt den Komplex III in der Elektronentransportkette und ermöglicht daher die Messung von OCR, die nicht mit den Mitochondrien verbunden sind.

Die verwendete Konzentration von Oligomycin wurde aus folgenden Gründen bestimmt: 1) Die empfohlene Dosis von Oligomycin für die meisten Zelltypen (isolierte Mitochondrien oder Zellkulturen) beträgt 1,5 μM. Aus Erfahrung wird normalerweise 3x-10x der dissoziierten Zelldosis für die Scheibenexperimente verwendet, da es einen Gradienten geben kann und das Eindringen von Lösung in die Scheiben Zeit in Anspruch nimmt. Daher sollte die Konzentration im Bereich von 5 μM bis 25 μM liegen. 2) Basierend auf Fried et al.25 wurde eine Konzentration von ²⁰ μM ausgewählt. Höhere Konzentrationen wurden aufgrund der unspezifischen Toxizität von Oligomycin nicht ausprobiert. 3) In dem Bericht von Underwood et al.26 führten die Autoren ein Titrationsexperiment für Oligomycin durch und fanden heraus, dass Dosen bei 6,25, 12,5, ²⁵ und 50 μg / ml zu einer ähnlichen Hemmung führten. Die höhere Konzentration von Oligomycin (50 μg/ml) hemmte nicht mehr, hatte aber eine größere Varianz. 4) Nach unserer Beobachtung scheint der bestimmende Faktor die Durchdringungsfähigkeit von Oligomycin zu sein. Es ist schwierig für Oligomycin, das Gewebe zu durchdringen, und deshalb dauert es mindestens 7 bis 8 Zyklen, um das Plateau, die maximale Reaktion, zu erreichen. Solange es das Plateau erreicht, wird die Hemmung als maximal angenommen.

Eine zentrale technische Herausforderung bei der Anpassung des extrazellulären Flussanalysators zur Messung der OCR in striatalen Schnitten besteht darin, Gewebehypoxie zu verhindern. Da der Puffer während der gesamten Messdauer (ca. 4 h) nicht mit Sauerstoff angereichert war, war die Hypoxie ein zentrales Thema. Dies gilt insbesondere für dickere Gewebeproben, bei denen Sauerstoff nicht durch die Proben diffundieren kann. Um dieses Problem zu lösen, wurden Scheiben mit einer Dicke von 150 μm geschnitten, so dass Umgebungssauerstoff die Mitte der Gehirnscheiben durchdringen konnte. Darüber hinaus wurden 4 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) dem voroxygenierten Puffer der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zugesetzt, was die Bestimmung der maximalen OCR erleichterte, wie zuvor vorgeschlagen²³. Wir untersuchten, ob Zellen am Leben waren. Zunächst wurden Hoechst 33258 (10 μM) und Propidiumiodid (10 μM) verwendet, um zu untersuchen, ob Zellen unter diesen Bedingungen gesund sind. Wir untersuchten dann, ob mittelstachelige Neuronen funktionell gesund waren, indem wir Patch-Clamp-Recording verwendeten. Wir bewerteten weiter, ob Dopamin (DA) -Terminals in den striatalen Scheiben funktionell gesund waren, indem wir die DA-Freisetzung mittels Fast-Scan-Voltammetrie maßen. Die Ergebnisse zeigten, dass striatale Scheiben, die nicht mit Sauerstoff angereichert waren (ACSF/BSA-Gruppe), genauso gesund waren wie die sauerstoffhaltige Kontrollgruppe²⁴.

Anschließend testeten wir verschiedene Kombinationen von Schichtdicke und Stanzgröße, um optimale striatale Schichtbedingungen für den Flussmittel-Atmungsassay zu bestimmen. Für die OCR-Analyse mit dem Analysator wurden dorsale Striatalscheiben mit unterschiedlichen Dicken (150 μm und 200 μm) und Stanzgrößen (1,0 mm, 1,5 mm und 2,0 mm Durchmesser) verwendet. Striatalscheiben, die 150 μm dick waren und eine Stanzgröße von 1,5 mm Durchmesser hatten, hatten die höchste Kopplungseffizienz und OCRs in einem optimalen Bereich für den Analysator²⁴.