Mesure du taux de consommation d’oxygène dans les tranches striatales aiguës de souris adultes

Le dysfonctionnement mitochondrial a été impliqué dans plusieurs maladies neurologiques, y compris la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la maladie d’Alzheimer ^1,2,3. Les modèles tels que les souris et les rats PINK1 knockout (KO) présentent une altération de la fonction mitochondriale ^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Les mitochondries isolées du striatum (STR) ou du cerveau entier d’une souris ROSE1 KO âgée présentent des défauts dans le complexe I ^7,10,12,13. La mesure directe du taux de consommation d’oxygène (OCR) est l’une des méthodes les plus courantes pour évaluer la fonction mitochondriale puisque l’OCR est couplée à la production d’ATP, la fonction principale des mitochondries¹⁴. Par conséquent, la mesure de l’OCR dans des modèles de maladie ou des échantillons / tissus dérivés du patient peut aider à étudier comment le dysfonctionnement mitochondrial conduit à la maladie.

Actuellement, il existe plusieurs façons de mesurer l’OCR mitochondriale, y compris l’électrode Clark et d’autres_électrodes O₂, le colorant fluorescent O 2 et ^{l’analyseur} de flux extracellulaire ^{15,16,17,18,19}. En avantage, les méthodes à base d’électrodes O₂ permettent d’ajouter facilement divers substrats. Cependant, ils sont insuffisants pour mesurer simultanément plusieurs échantillons. Par rapport aux méthodes_{traditionnelles} à base d’électrodes O 2, l’analyseur de flux extracellulaire, un outil couramment utilisé pour l’OCR dans les cultures cellulaires ou les mitochondries purifiées, offre un débit amélioré ^{de 15,18,20}. Néanmoins, toutes ces méthodes sont généralement appliquées pour mesurer l’OCR dans des mitochondries isolées ou des cultures ^{cellulaires 6,16,17,19,20,21}. L’isolement des mitochondries cause des dommages par inadvertance, et les mitochondries extraites ou les cultures cellulaires sont moins pertinentes physiologiquement que les tranches de cerveau intactes²². Même lorsque les microélectrodes sont utilisées en tranches, elles sont moins sensibles et plus difficiles à utiliser que dans les cellules cultivées²³.

Pour relever ces défis, nous avons développé une méthode utilisant l’analyseur de flux extracellulaire XF24, qui permet d’analyser plusieurs paramètres métaboliques à partir de tranches cérébrales striatales aiguës de souris²⁴. Cette technique fournit une quantification directe continue de la respiration mitochondriale via l’OCR. En bref, de petites sections de tranches cérébrales striatales sont placées dans des puits de la plaque d’îlot, et l’analyseur utilise des biocapteurs fluorescents à base d’oxygène et de protons pour mesurer l’OCR et le taux d’acidification extracellulaire, respectivement 17,21,25.

L’une des caractéristiques uniques de l’analyseur est les quatre puits d’injection, qui permettent la mesure continue de l’OCR tout en injectant séquentiellement jusqu’à quatre composés ou réactifs; cela permet de mesurer plusieurs paramètres de respiration cellulaire, tels que l’OCR mitochondriale basale, l’OCR liée à l’ATP et l’OCR mitochondriale maximale. Les composés injectés lors des mesures pour le protocole montrés ici étaient des concentrations de travail de 10 mM de pyruvate dans le puits de la première solution (port A), de 20 μM d’oligomycine dans le puits de la deuxième solution (port B), de 10 μM de cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP) dans le troisième puits (port C) et de 20 μM d’antimycine A dans le quatrième puits (port D), d’après Fried et ^al.25. Il convient de noter que ces concentrations étaient des concentrations de travail et que des solutions mères de 10x, 11x, 12x et 13x ont été injectées dans les ports de solution A à D, respectivement. Le but de l’utilisation de chaque solution était le suivant: 1) Le pyruvate était nécessaire car, sans lui, l’ajout de FCCP aurait une réponse OCR diminuée causée par une limitation des substrats disponibles; 2) L’oligomycine inhibe l’ATP synthase et permet de mesurer la respiration liée à l’ATP; 3) FCCP découple l’oxydation de la phosphorylation et permet la mesure de la capacité mitochondriale maximale; 4) L’antimycine A inhibe le complexe III dans la chaîne de transport d’électrons et, par conséquent, permet la mesure de l’OCR non liée aux mitochondries.

La concentration d’oligomycine utilisée a été déterminée pour les raisons suivantes : 1) La dose recommandée d’oligomycine pour la plupart des types de cellules (mitochondries isolées ou cultures cellulaires) est de 1,5 μM. D’après l’expérience, généralement 3x-10x de la dose de cellules dissociées est utilisée pour les expériences de tranches, car il peut y avoir un gradient et la pénétration de la solution dans les tranches prend du temps. Par conséquent, la concentration doit être comprise entre 5 μM et 25 μM. 2) Une concentration de 20 μM a été choisie sur la base de Fried et ^al.25. Des concentrations plus élevées n’ont pas été essayées en raison de la toxicité non spécifique de l’olélicine. 3) Dans le rapport d’Underwood et ^al.26, les auteurs ont fait une expérience de titrage pour l’oligomycine et ont constaté que des doses de 6,25, 12,5, 25 et 50 μg / mL entraînaient une inhibition similaire. La concentration plus élevée d’oligomycine (50 μg/mL) n’a pas inhibé davantage, mais a eu une plus grande variance. 4) Dans notre observation, le facteur déterminant semble être la capacité de pénétration de l’olligomycine. Il est difficile pour l’oligomycine de pénétrer dans le tissu, et c’est pourquoi il faut au moins 7 à 8 cycles pour atteindre le plateau, la réponse maximale. Tant qu’il atteint le plateau, l’inhibition est supposée être maximale.

L’un des principaux défis techniques de l’adaptation de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer l’OCR dans les tranches striatales est de prévenir l’hypoxie tissulaire. Comme le tampon n’a pas été oxygéné pendant toute la durée des mesures (environ 4 h), l’hypoxie était un problème central. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons de tissus plus épais, où l’oxygène ne peut pas diffuser dans les échantillons. Pour surmonter ce problème, des tranches ont été sectionnées à 150 μm d’épaisseur, de sorte que l’oxygène ambiant puisse pénétrer au milieu des tranches de cerveau. De plus, 4 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) ont été ajoutés au tampon du liquide céphalo-rachidien artificiel préoxygéné (ACSF), ce qui a facilité la détermination de l’OCR maximale, comme suggéré précédemment²³. Nous avons examiné si les cellules étaient vivantes. Tout d’abord, Hoechst 33258 (10 μM) et l’iodure de propidium (10 μM) ont été utilisés pour examiner si les cellules étaient saines dans ces conditions. Nous avons ensuite examiné si les neurones épineux moyens étaient fonctionnellement sains à l’aide de l’enregistrement patch-clamp. Nous avons ensuite évalué si les terminaux dopaminergiques (DA) dans les tranches striatales étaient fonctionnellement sains en mesurant la libération de DA à l’aide de la voltampérométrie à balayage rapide. Les résultats ont montré que les tranches striatales qui n’étaient pas oxygénées (groupe ACSF/BSA) étaient aussi saines que le groupe témoin^{oxygéné 24}.

Nous avons ensuite testé différentes combinaisons d’épaisseur de tranche et de taille de poinçon pour déterminer les conditions optimales de la tranche striatale pour le test de respiration de flux. Des tranches striatales dorsales de différentes épaisseurs (150 μm et 200 μm) et de différentes tailles de poinçonnage (1,0 mm, 1,5 mm et 2,0 mm de diamètre) ont été utilisées pour l’analyse OCR à l’aide de l’analyseur. Les tranches striatales de 150 μm d’épaisseur avec une taille de poinçon de 1,5 mm de diamètre avaient l’efficacité de couplage la plus élevée et des OCR dans une plage optimale pour l’analyseur²⁴.