Monitoraggio dinamico della sieroconversione utilizzando un test multianalyte immunobead per Covid-19

Risultati tipici dei test e valutazioni delle prestazioniI saggi immunobeadi forniscono comunemente una curva sigmoidale quando valutati su diversi ordini di grandezza (log), come illustrato in ciascuno dei pannelli presentati nella Figura 1. L’utente deve definire sperimentalmente l’intervallo di concentrazione ottimale per ciascun analita nel multiplex per determinare l’intero intervallo di quantificazione, assicurandosi di non sovracampionare gli estremi (aree che si avvicinano al limite inferiore di quantificazione [LLOQ] o al limite superiore di quantificazione [ULOQ]). L’intervallo effettivo richiesto per un test, tuttavia, è dettato dalla distribuzione degli analiti bersaglio in una matrice biologica (cioè le “incognite”) a un dato fattore di diluizione. Inoltre, sebbene le curve standard siano tipicamente interpretate tramite regressione lineare con un algoritmo di adattamento parametrico a 4 o 5 parametri, la porzione lineare di una data curva fornisce in genere la massima fiducia nell’accuratezza quantitativa con un modello lineare (y = mx + b) di quantificazione. Abbinare la curva di calibrazione ai valori osservati per un’incognita a un dato fattore di diluizione dovrebbe essere l’obiettivo nello sviluppo del saggio quantitativo. A questo proposito, è stata valutata una curva standard a 7 punti basata su una serie di diluizioni seriali 1:5 per ciascuno degli anticorpi Spike S1, Nucleocapsid e Membrane che variano tra 1 μg/mL e 0,000064 μg/mL per Spike S1 e Nucleocapsid e 5 μg/mL e 0,00032 μg/mL per Membrane, come mostrato nella Figura 1. Il limite inferiore di rilevazione (LLOD) per ciascun test è stato definito come la più bassa concentrazione di analita che ha prodotto un segnale distinguibile dal suo sfondo. LLOD può essere identificato dall’equazione descritta in precedenza 8,9, LLOD = LoB + 1.645 (campionesD a bassa concentrazione). LoB è il limite inferiore del bianco, ed è la concentrazione “apparente” di analita che viene prodotta dal bianco quando è previsto un valore zero, e può essere accertato usando questa equazione LoB =Vuoto medio + 1.645 (SDvuoto)8. Sulla base di questo metodo, i valori MFI per il test Spike S1 variavano da 134,38 a 20191,2, con 134,38 MFI che rappresentavano 0,00024 μg / mL e definiti come LLOD. Per il test a membrana, l’intervallo pratico di MFI era compreso tra 52,24 e 4764,9, con 52,24 MFI calcolato in 0,004885 μg / mL e assegnato come LLOD. L’intervallo MFI per il test Nucleocapsid era compreso tra 517,9 e 19666,34, con 517,9 specificato come 0,00024 μg / mL, che era il LLOD. Il limite superiore di rilevazione (ULOD) è definito come la concentrazione di analita dopo la quale la variazione dell’IFM non è più lineare e la risposta del segnale è satura. Va notato che il carattere sigmoidale completo di queste curve non è osservabile per gli standard testati, ad eccezione della curva nucleocapside. Tuttavia, dati i valori MFI osservati per tutte le incognite analizzate fino ad oggi (a una diluizione 1:500) rientrano nell’intervallo di curva presentato per ciascun analita e sono facilmente quantificabili utilizzando un adattamento parametrico a 4 o 5 tramite regressione lineare. Precisione del saggioPrecisione intra-saggio: quattro repliche di saggi sono state eseguite sulla stessa piastra per valutare la precisione del saggio, calcolata come %CV, o quoziente della deviazione standard e la media moltiplicata per 100. Per queste tabulazioni sono stati selezionati i punti standard 2 e 5, con i valori catalogati nella Tabella 2. La tipica soglia limite superiore accettabile per i valori %CV è ≤20%, che è stata osservata per questi dati, ad eccezione di quella per lo standard 2 di Membrane IgG, che probabilmente deriva da livelli di fondo e può essere rettificato eliminando i valori periferici (dati non mostrati). Va notato che è stata osservata un’apparente instabilità del valore di lettura per i saggi di membrana in cui i valori MFI erano <200, più comunemente nel caso degli isotipi IgA e IgM. Precisione tra i test: tre distinti lotti di set di perline sono stati preparati e testati per ciascun test, come definito per la precisione intra-saggio (sopra e come visto nella Figura 1). La variabilità tra i test è stata valutata calcolando il %CV dai risultati medi per ciascuno dei tre lotti, come mostrato nella Tabella 3. Anche in questo caso, la soglia limite superiore per un %CV accettabile è fissata a ≤20%, che esiste per tutte le condizioni testate (con un effetto simile con lo standard 2 di Membrane IgG, come visto sopra). Va notato che la variabilità da lotto a lotto nei valori netti di IFM è comunemente osservata all’interno di più lotti degli stessi immunoreagenti durante lo sviluppo di test personalizzati. L’uso di una curva di calibrazione eretta da un anticorpo anti-bersaglio ottenuto commercialmente (ad esempio, coniglio anti-Spike S1) seguito da un anticorpo anti-specie di rilevamento può fornire coerenza nei risultati analitici e consentire confronti tra più lotti in diversi periodi di tempo. Precisione inter-test con campioni umani: la valutazione della precisione inter-assay è stata ripetuta con campioni di plasma umano (n = 5) raccolti entro un mese dai primi sintomi riportati per un’infezione da SARS-CoV-2; realizzato con tre distinti lotti di saggi (cioè diversi preparati dei set di perline). Questi risultati sono illustrati nella Tabella 4 e dimostrano la precisione con un valore %CV con il tipico valore limite di soglia superiore di ≤20%. I valori medi %CV per i titoli Spike S1, Nucleocapsid e Membrane IgG sono stati calcolati rispettivamente al 9,9% (intervallo 2,6%-18%), all’11,0% (intervallo 3,5%-24,4%) e al 7,6% (intervallo 3,2%-12,9%). Osservazioni simili sono state fatte con i titoli IgM e IgA di questi tre analiti, tutti fornendo valori %CV <20%. L'unica eccezione a questo è stata la materia 5 titoli IgM per la proteina di membrana, che è stata successivamente esclusa come outlier. I valori di precisione per le valutazioni del soggetto umano sono coerenti con quelli osservati sopra per gli anticorpi del coniglio, il che suggerisce che questi saggi possono essere facilmente riconfigurati per valutare i titoli degli antigeni in più specie con un impatto minimo sulla precisione del test. Come notato sopra, c'è stata un'apparente instabilità nel leggere i valori osservati per i saggi di membrana in cui i valori MFI erano <200, più comunemente nel caso degli isotipi IgA e IgM. Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi primariIl “tempo di cattura” dell’analita è stato valutato con le perle coniugate con antigene e gli anticorpi nei campioni di plasma o negli standard sono stati testati modificando la durata dell’incubazione primaria (30 min, 1 h, 2 h e 4 h). La differenza tra l’IFM media è presentata come il quoziente di una specifica incubazione e il tempo massimo di incubazione, chiamato % Max., nella Figura 2, tra un’incubazione di 30 minuti (durata minima) e un’incubazione di 4 ore (durata massima). I valori a 120 minuti erano ottimali per i titoli IgG per gli anticorpi Spike S1, Membrane e Nucleocapsid, indicando una cinetica di legame anticorpale primaria veloce, consentendo flessibilità per aumentare la produttività del test. Tuttavia, sono state osservate cinetiche più lente per gli isotipi IgA e IgM (dati non mostrati), dimostrando i livelli di cattura di picco al punto temporale di 4 ore, come mostrato nella Figura 2. Nel complesso, esiste un equilibrio tra l’approccio alla saturazione del saggio e l’opportunità di tempo pratico per l’esecuzione di ciascun test durante la produzione (per massimizzare la produttività). Con questo, in questi risultati sono stati osservati segnali adatti per scopi quantitativi a tempi di incubazione minimi di 30 minuti per IgG, 60 minuti per IgM e 120 minuti per IgA. Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondariSono state testate cinque concentrazioni di anticorpi secondari (IgG anti-umana di capra, coniugato con PE; IgA anti-umano di capra, coniugato con PE; IgM anti-umano di capra, coniugato SB) (0,5, 1, 2, 4 e 8 μg / mL). Tutti gli anticorpi hanno rivelato ampi intervalli di segnale, senza un’evidente saturazione del segnale in nessuna condizione, garantendo così una misurazione lineare per una qualsiasi delle concentrazioni. Ad esempio, il segnale medio generato dal test Spike S1 utilizzando IgM anti-umani di capra, coniugato SB a 0,5 μg/mL era il 13,2% dell’IFM generato dal segnale massimo (8 μg/mL), mentre l’IFM generata da 4 μg/mL era il 73,3% dell’IFM manifestata al segnale massimo. I dettagli della gamma di segnali provenienti dagli altri isotipi degli anticorpi Spike S1, degli anticorpi di membrana e degli anticorpi nucleocapsidi sono inclusi nella Tabella 5 e nella Figura 3. Come punto pratico, l’impatto primario tra la concentrazione ottimale di anticorpi secondari e la concentrazione di anticorpi secondari 4 μg/mL precedentemente dichiarata si riflette in termini di sensibilità del saggio e costo del test. Cioè, una concentrazione di anticorpi secondari di 8 μg / mL può essere desiderabile per l’applicazione con titoli anticorpali bassi o basse quantità di campione prezioso, ma il costo associato a questi saggi sarebbe considerevolmente superiore all’uso della concentrazione di 4 μg / mL precedentemente definita. Inversamente, i casi in cui si osservassero titoli anticorpali elevati (come individui che hanno subito vaccinazioni Covid-19 o con quantità non limitanti di sieri) vedrebbero un rapporto costi-benefici attraverso l’applicazione delle quantità inferiori di anticorpi secondari (ad esempio, 1 μg / mL). Ottimizzazione dell’incubazione degli anticorpi secondariLa potenziale influenza della durata dell’incubazione dell’anticorpo secondario è stata studiata anche modificando la durata dell’incubazione (15, 30, 60 e 120 min). Generalmente, la differenza tra l’IFM media presentata come il quoziente di un’incubazione specifica e il tempo massimo di incubazione, denominato %Max, tra un’incubazione di 15 minuti (durata minima) e un’incubazione di 120 minuti (durata massima) non ha superato il 30%, il 55% e il 50% rispettivamente per gli anticorpi Spike S1, membrana e nucleocapside, indicando una fase cinetica veloce nel legame anticorpale secondario e un mezzo per aumentare la produttività del saggio. La Tabella 6 include dettagli sulle variazioni del segnale per tutti i tempi di incubazione. Le illustrazioni dei segnali osservati da diverse incubazioni di questa analisi sono mostrate nella Figura 4. Prestazioni e specificità del doppio canalePer ogni analita, una singola esecuzione del formato reporter (solo IgG-PE, solo IgA-PE o solo IgM-SB) è stata confrontata con il segnale generato per lo stesso analita quando è stato eseguito in un formato dual-reporter (ad esempio, Spike S1 IgG-PE solo contro Spike S1 IgG-PE in combinazione con Spike S1 IgM-SB nel formato dual-reporter). La precisione del saggio (espressa in %CV) per i segnali creati nei due formati è stata utilizzata per analizzare la relazione nei risultati di questo esperimento. I valori %CV dei saggi Spike S1 erano rispettivamente del 6,19%, 16,4% e 23% per IgM, IgG e IgA. Per il test di membrana, i valori %CV erano rispettivamente del 3,3%, 7,9% e 16,4% per IgM, IgG e IgA. Infine, il test Nucleocapsid ha fornito valori %CV all’8,7%, 10,3% e 24,2% rispettivamente per IgM, IgG e IgA. I valori di precisione osservati per gli isotipi IgM e IgA suggeriscono che un tempo di incubazione più lungo può conferire risultati di test superiori a causa delle note differenze cinetiche di legame tra queste classi di immunoglobuline. La Figura 4 mostra l’accordo tra i formati delle diverse concentrazioni di anticorpi secondari. Per confermare la specificità dei canali reporter, un singolo canale reporter è stato testato contemporaneamente mentre l’altro canale è stato assegnato come vuoto per informarsi sul segnale non specifico (effetto sanguinamento). Questi risultati indicano che c’è una trascurabile contaminazione cross-signal tra i due canali reporter, data l’elevata specificità in tutto lo spettro delle condizioni. Questi risultati sono illustrati nella Figura 5. Nel complesso, abbiamo osservato un’interferenza del 6,45% tra il canale 1 e il canale 2. Tuttavia, quando è stata presa in considerazione l’entità dei segnali, abbiamo osservato i seguenti potenziali livelli di interferenza in modalità dual reporter: Spike IgG / IgM al 71,98%, Spike IgA / IgM al 28,11%; Membrana IgG/IgM al 7,41%, Membrana IgA/IgM al 134,61%; e Nucleocapsid IgG/IgM al 146,03%, Nucleocapsid IgA/IgM al 112,13%. Nella configurazione specificata, ciò richiederebbe la misurazione di Spike IgM in combinazione con l’isotipo IgA, L’IgM di membrana con l’isotipo IgM e le misurazioni nucleocapsidi non eseguite in un formato a doppio canale. Questa scoperta potrebbe richiedere l’esplorazione dell’inversione della strategia di etichettatura in base alla quale IgA e IgG devono essere misurate nel canale 2 e IgM nel canale 1. Valutazione degli eventi di sieroconversione a seguito della vaccinazione Covid-19La sieroconversione è stata monitorata in quattro soggetti dopo la valutazione di IgA, IgM e IgG con il test Spike S1 in momenti che vanno dalla pre-vaccinazione a quattro mesi dopo il completamento della serie di vaccinazioni Covid-19. Le misurazioni sono state effettuate in modalità a doppio canale (IgG / IgM e IgA / IgM, con valori IgM medi). Tutti i soggetti hanno ricevuto il vaccino come immunizzazione in 2 fasi, secondo la pratica standard, con un intervallo di 21 giorni tra la prima e la seconda dose. I grafici della risposta immunitaria di ciascun soggetto sono mostrati nella Figura 6A-C. I valori di risposta immunitaria per gli antigeni nucleocapside e di membrana sono stati osservati a livelli di fondo per tutte le immunoglobuline valutate (dati non mostrati), il che era coerente con i soggetti che non avevano documentato una precedente infezione da SARS-CoV-2 nel tempo precedente la vaccinazione. Nel complesso, i valori di Spike S1 IgA e IgM osservati erano circa 40 volte inferiori ai titoli isotipi IgG, con titoli di picco che aumentavano non appena 14 giorni per entrambi gli isotipi IgM e IgG e l’isotipo IgA raggiungeva i titoli di picco tra il tempo della seconda dose (giorno 0) e 14 giorni dopo la seconda dose, a seconda del soggetto. In particolare, i titoli Spike S1 IgG iniziano a decadere nel corso dei quattro mesi successivi al completamento della vaccinazione a un tasso altamente variabile, in modo dipendente dal soggetto. Figura 1: Curve standard rappresentative a 3 plex. Curve standard rappresentative per i tre analiti; presentato come una curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da (A) 1 μg/mL per Spike S1, (B) 5 μg/mL per Membrana e (C) 1 μg/mL per Nucleocapside e anticorpi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Ottimizzazione del tempo di incubazione dell’anticorpo primario/campione: il segnale MFI medio prodotto da diversi tempi di incubazione di anticorpi/campioni primari (cattura anticorpale) che vanno da 30 minuti a 4 ore per gli standard 1-7 (come indicato nella Tabella 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari e prestazioni a doppio canale. Le curve illustrano l’IFM media (normalizzata al valore più alto registrato nella serie) prodotta da concentrazioni di anticorpi secondari testati, comprese tra 0,5-8 μg/ml. Ogni istanza è stata eseguita sia come test a canale singolo che a doppio canale per apprezzare le differenze nel formato sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari, formato a doppio canale. Grafici rappresentativi dei valori MFI osservati (normalizzati al valore più alto registrato nella serie) rispetto al tempo di incubazione con anticorpi secondari. Gli esperimenti sono stati eseguiti come saggi a doppio canale come combinazioni (A-C) IgA / IgM o (D-F) IgG / IgM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Valutazioni di specificità per saggi a doppio canale. Risultati del test del formato di saggio a doppio canale con uno di ogni combinazione designato come vuoto per illustrare la mancanza di fluorescenza o interferenza cross-channel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Illustrazione della sieroconversione a seguito della vaccinazione Covid-19. Grafici che illustrano i titoli relativi degli anticorpi (A) IgG, (B) IgM e (C) IgA per l’antigene Spike S1 durante il corso della vaccinazione Covid-19 (Pre-vaccinazione – 4 mesi dopo il completamento); il tempo è indicato in giorni relativi al completamento della serie di vaccinazioni; sono indicati i punti generali della somministrazione del vaccino (linee rosse). Gli esperimenti sono stati eseguiti in modalità a doppio canale, come descritto nel Protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Numero Standard Serie di diluizione Anti-Spike S1 o N (μg/mL) Anti-membrana (μg/mL) Vuoto Vuoto – – 1 STD7 1:1 1 5 2 STD6 1:5 0.2 1 3 STD5 1:25 0.04 0.2 4 STD4 1:125 0.008 0.04 5 STD3 1:625 0.0016 0.008 6 STD2 1:3125 0.00032 0.0016 7 STD1 1:15625 0.000064 0.00032 Tabella 1: Serie di diluizione per curve standard: Tabella dei fattori di diluizione utilizzati per le curve standard per il sierotipo IgG; presentato come una curva di diluizione seriale 1:5 a 7 punti a partire da 1 μg/mL per α-Spike S1 e α-Nucleocapsid e 5 μg/mL per gli anticorpi α-Membrana. Analita Campione Rep 1 Rep 2 Rep 3 · Rep 4 Ave Sd %CV Picco S1 STD2 · 369.4 356.9 295.2 271.5 323.3 47.4 14.6 STD5 · 3869.1 3437 3970.2 4240.7 3879.3 334 8.6 Membrana STD2 · 40.6 37.7 49.9 27.8 39 9.1 23.3 STD5 · 733.2 731.3 724 678.1 716.7 26 3.6 Nucleocapside STD2 · 1746.7 1790.8 1577.3 1664.8 1694.9 94.2 5.6 STD5 · 15598.1 14735.5 18369.5 17408.5 16527.9 1657.7 10 Tabella 2: Precisione intradosaggio: Coefficiente percentuale di varianza (%CV) calcolato da quattro repliche di miscele di anticorpi standard allo standard 2 (STD2) e allo standard 5 (STD5) con un singolo lotto di test nello stesso esperimento. I valori forniti per le repliche e le medie rappresentano i valori delle IFM osservati. Analita Campione Lotto 1 Lotto 2 Lotto3 Ave Sd %CV Picco S1 STD2 · 383.2 424.4 379.9 395.8 24.8 6.3 STD5 · 5639.7 6062.5 6384.3 6028.8 373.4 6.2 Membrana STD2 · 39.1 58.5 59.1 52.2 11.4 21.8 STD5 · 732.3 941.4 701.1 791.6 130.7 16.5 Nucleocapside STD2 · 1342.6 1621 1718.2 1560.6 195 12.5 STD5 · 13543.9 14843.2 17883.4 15423.5 2227.2 14.4 Tabella 3: Precisione inter-saggio con campioni standard: Coefficiente percentuale di varianza (%CV) calcolato da tre distinti lotti di saggi, valutati allo standard 2 e allo standard 5 nello stesso esperimento. I valori forniti per le repliche e le medie rappresentano i valori delle IFM osservati. IgG-PE IgM-SB IgA-PE Ave. MFI %CV Ave. MFI %CV Ave. MFI %CV Picco S1 Oggetto 1 8002.3 17.7 1949.5 1.3 2045.8 5.5 Oggetto 2 19155.8 7.3 918.6 4.1 1684.5 3.9 Oggetto 3 17865.6 18.0 549.4 3.8 961.3 8.1 Oggetto 4 11901.1 2.6 1603 4.8 8736.4 5.5 Oggetto 5 9801.8 4.0 1014.1 3.0 2747.6 9.3 Nucleocapside Oggetto 1 15097.8 11.3 1049.7 9.9 5276.5 3.9 Oggetto 2 15204.3 12.1 265.9 5.2 6761.3 11.9 Oggetto 3 18471.7 24.4 329.1 4.5 14308 2.9 Oggetto 4 16424.7 3.5 2418.1 0.1 4234.7 4.2 Oggetto 5 13344.9 3.6 225.6 10.0 13436.5 9.7 Membrana Oggetto 1 514.6 8.6 180.6 14.0 141.2 9.8 Oggetto 2 196.8 5.2 57 20.7 55.5 13.0 Oggetto 3 553.7 12.9 54.5 21.2 191.2 18.6 Oggetto 4 377.9 3.2 68.1 22.1 62 2.3 Oggetto 5 325.4 8.2 11.4 91.6 74.6 20.8 Tabella 4: Precisione inter-saggio con campioni umani: Coefficiente percentuale medio di varianza (%CV) calcolato da tre lotti di saggi testati con campioni di plasma (diluiti 500 volte) da cinque soggetti umani con infezioni da SARS-CoV-2. Picco S1 Membrana Nucleocapside μg/mL Ave. MFI % Max. Ave. MFI % Max. Ave. MFI % Max. Igm 0.5 186 13.2 32 25.2 132.7 13.6 1 304.2 21.6 45.8 36 194.4 19.9 2 664.5 47.2 78.8 61.9 458.2 47 4 1032.1 73.3 101.3 79.6 707.8 72.6 8 1407.1 100 127.2 100 975 100 IgG 0.5 809.7 4.9 27.5 15 1355.6 6.3 1 1696.9 10.2 40.6 22.2 2782.1 13 2 4543.8 27.3 68.3 37.3 6661.2 31.2 4 10003.5 60 110.7 60.5 12605.6 59 8 16662.8 100 182.9 100 21360.6 100 IgA 0.5 797.4 19.3 31.1 47.2 2056.5 16.1 1 1529.5 37 41.4 62.8 3869 30.4 2 2261.3 54.7 48.6 73.3 6648.9 52.2 4 2320.4 56.2 48.3 73.2 6548.1 51.4 8 4132.2 100 65.9 100 12744.8 100 Tabella 5: Ottimizzazione della concentrazione di anticorpi secondari: Il segnale MFI medio prodotto da diverse concentrazioni di anticorpi secondari che vanno da 0,5 μg/mL a 8 μg/mL. Il valore di ciascun segnale è anche presentato come percentuale del segnale a 8 μg/mL (“Max.”) per dimostrare la grandezza relativa del segnale. Picco S1 Membrana Nucleocapside Tempo di incubazione (min.) Ave. MFI % Max. Ave. MFI % Max. Ave. MFI % Max. Igm 15 1185 72.2 40.4 48.9 609.5 53.3 30 1416.6 86.3 58.4 70.7 894.2 78.2 60 1324.8 80.7 73.6 89.1 945.6 82.7 120 1641.2 100 82.6 100 1143.2 100 IgG 15 12917.6 80.5 244.4 44.9 15429.8 80.8 30 14915.4 92.9 434.7 79.9 18797 98.5 60 15340.3 95.6 421.4 77.5 18694.4 97.9 120 16050.3 100 544 100 19085.8 100 IgA 15 3141.9 78.2 75 66.8 9103 86.6 30 3569.1 88.8 83.9 74.8 9563.8 91 60 3539.1 88 86 76.6 9555.7 90.9 120 4020 100 112.2 100 10512.9 100 Tabella 6: Ottimizzazione del tempo di incubazione degli anticorpi secondari: Il segnale MFI medio prodotto da diversi tempi di incubazione di anticorpi secondari che vanno da 15 min a 120 min. Il valore di ciascun segnale è anche rappresentato come percentuale del segnale a 120 minuti (“Max.”) per dimostrare la grandezza relativa del segnale.