القياس الكمي لأنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو الفلوريسين ثنائي كلورو فلوريسين 2′,7′ وقياس التدفق الخلوي في خلايا مولر الدبقية
Summary
هنا ، نقترح بروتوكولا منهجيا ويمكن الوصول إليه وقابلا للتكرار للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية الخلوية (ROS) باستخدام مسبار ثنائي أسيتات ثنائي كلورو فلوروريسين ثنائي الفلور 2′,7′ (DCFH-DA) في خلايا مولر الدبقية (MGCs). تحدد هذه الطريقة إجمالي مستويات ROS الخلوية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. هذا البروتوكول سهل الاستخدام للغاية ومناسب وقابل للتكرار.
Abstract
توازن الأكسدة والاختزال له دور مهم في الحفاظ على التوازن الخلوي. يعزز الجيل المتزايد من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تعديل البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما قد يؤدي في النهاية إلى تغيير في الوظيفة الخلوية وموت الخلايا. لذلك ، من المفيد للخلايا زيادة دفاعها المضاد للأكسدة استجابة للإهانات الضارة ، إما عن طريق تنشيط مسار مضاد للأكسدة مثل Keap1 / Nrf2 أو عن طريق تحسين زبالات الأكسدة والاختزال (الفيتامينات A و C و E β كاروتين والبوليفينول ، من بين أمور أخرى). يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي في التسبب في اعتلال الشبكية وتطوره ، مثل اعتلال الشبكية السكري (DR) واعتلال الشبكية الخداجي (ROP). نظرا لأن خلايا مولر الدبقية (MGCs) تلعب دورا رئيسيا في توازن أنسجة الشبكية العصبية ، فإنها تعتبر نموذجا مثاليا لدراسة آليات الحماية الخلوية هذه. وبهذا المعنى ، فإن تحديد مستويات ROS كميا بطريقة بسيطة وقابلة للتكرار أمر ضروري لتقييم مساهمة المسارات أو الجزيئات التي تشارك في آلية الدفاع عن الخلايا المضادة للأكسدة. في هذه المقالة ، نقدم وصفا كاملا للإجراءات المطلوبة لقياس ROS باستخدام مسبار DCFH-DA وقياس التدفق الخلوي في MGCs. يتم توفير الخطوات الرئيسية لمعالجة بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام البرنامج هنا ، بحيث سيتمكن القراء من قياس مستويات ROS (الوسائل الهندسية ل FITC) وتحليل الرسوم البيانية الفلورية. هذه الأدوات مفيدة للغاية لتقييم ليس فقط الزيادة في ROS بعد إهانة خلوية ولكن أيضا لدراسة التأثير المضاد للأكسدة لبعض الجزيئات التي يمكن أن توفر تأثيرا وقائيا على الخلايا.
Introduction
الشبكية العصبية هي نسيج منظم للغاية يقدم طبقات عصبية محددة جيدا. في هذه ، ترتبط الخلايا العصبية (العقدة ، الأمكرين ، الخلايا ثنائية القطب ، الأفقية ، والمستقبلات الضوئية) ببعضها البعض وكذلك مع خلايا مولر الدبقية (MGCs) والخلايا النجمية ، مما يؤدي إلى نقل ضوئي كاف ومعالجة المعلومات البصرية 1,2. من المعروف أن MGCs لها دور مهم في الحفاظ على توازن الشبكية لأنها تعبر قسم الشبكية بأكمله ، وبالتالي ، يمكنها التفاعل مع جميع أنواع الخلايا التي تعدل عمليات الحماية المتعددة. وقد أفيد أن MGCs لديها العديد من الوظائف الهامة للحفاظ على وبقاء الخلايا العصبية الشبكية ، بما في ذلك تحلل السكر لتوفير الطاقة للخلايا العصبية ، وإزالة النفايات العصبية ، وإعادة تدوير الناقلات العصبية ، وإطلاق عوامل التغذية العصبية ، من بين أمور أخرى3،4،5.
من ناحية أخرى ، يشارك الالتهاب والإجهاد التأكسدي والنيتروجيني في التسبب في العديد من الأمراض البشرية وتطورها ، بما في ذلك اعتلالات الشبكية6،7،8،9،10،11. يعتمد توازن الأكسدة والاختزال في الخلايا على التنظيم الصارم لمستويات ROS. يتم إنشاء ROS باستمرار في ظل الظروف الفسيولوجية نتيجة للتنفس الهوائي بشكل رئيسي. يشمل الأعضاء الرئيسيون في عائلة ROS الجذور الحرة التفاعلية مثل أنيون الأكسيد الفائق (O 2 ̘ ̘ •−) ، وجذور الهيدروكسيل (•OH) ، والبيروكسيدات المختلفة (ROOR′) ، والهيدروبيروكسيدات (ROOH) ، وبيروكسيد الهيدروجين غير الجذري (H 2 O 2)12,13. في السنوات الأخيرة ، أصبح من الواضح أن ROS يلعب دورا مهما في الإشارة في الخلايا من خلال التحكم في العمليات الأساسية. تتمتع MGCs بدفاع قوي مضاد للأكسدة عن طريق تنشيط العامل النووي النسخي الإريثرويد 2 المرتبط بالعامل 2 (Nrf2) والتعبير اللاحق عن البروتينات المضادة للأكسدة للقضاء على الإنتاج المفرط ل ROS في ظل الظروف المرضية14،15،16. عندما تفقد الخلايا توازن الأكسدة والاختزال بسبب الإنتاج المبالغ فيه ل ROS أو القدرة المعيبة على إزالة ROS ، فإن تراكم الإجهاد التأكسدي يعزز التعديلات الضارة في البروتينات والدهون والحمض النووي ، مما يؤدي إلى الإجهاد الخلوي أو الموت. تعمل زيادة نظام الدفاع المضاد للأكسدة في الشبكية على تحسين دقة اعتلالات الشبكية والوقاية منها ، مثل ROP و RD 17,18,19,20,21,22,23,24. لذلك ، يعد قياس إنتاج ROS في الوقت الفعلي أداة قوية ومفيدة.
هناك عدة طرق لقياس إنتاج ROS أو الإجهاد التأكسدي في الخلايا. من بين هذه ، مسبار ثنائي الأسيتات ثنائي كلورو فلوريسين ثنائي الفلور ثنائي الأسيتات (DCFH-DA) هو واحد من أكثر التقنيات استخداما على نطاق واسع لتحديد حالة الأكسدة والاختزال للخلية مباشرة25،26،27،28. هذا المسبار محب للدهون وغير فلورسنت. يسمح انتشار هذا المسبار عبر غشاء الخلية بانقسامه بواسطة الاسترازات داخل الخلايا في رابطتي الإستر ، مما ينتج منتجا قطبيا نسبيا وغير منفذ بغشاء الخلية ، 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). يتراكم هذا الجزيء غير الفلوري داخل الخلايا ، وينتج عن الأكسدة اللاحقة بواسطة ROS المنتج DCF عالي الفلورسنت. أكسدة المسبار هي نتاج عمل أنواع متعددة من ROS (البيروكسينتريت ، جذور الهيدروكسيل ، أكسيد النيتريك ، أو البيروكسيدات) ، والتي يمكن اكتشافها عن طريق قياس التدفق الخلوي أو المجهر البؤري (الانبعاثات عند 530 نانومتر والإثارة عند 485 نانومتر). الحد من هذه التقنية هو أن الأكسيد الفائق وبيروكسيد الهيدروجين لا يتفاعلان بقوة مع H2DCF25,29. في هذه المقالة ، نستخدم مسبار DCFH-DA لقياس وقياس ROS عن طريق قياس التدفق الخلوي. لهذا السبب ، فإننا نحث على إنتاج ROS عن طريق تحفيز MGCs باستخدام محفز ROS ، A أو B ، قبل تحميل الخلايا باستخدام مسبار الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم مركبا مضادا للأكسدة. أخيرا ، نعرض بيانات تمثيلية وموثوقة تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الحالات المرضية ، مثل السرطان والأمراض الالتهابية ونقص التروية / التروية وأمراض القلب الإقفارية والسكري واعتلال الشبكية ، وكذلك الحالات الفسيولوجية مثل الشيخوخة ، تؤدي إلى فرط إنتاج ROS6،7،8،9،10<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا ماريا بيلار كريسبو وبولا أليخاندرا أبادي من مركز البحوث في مجال الكيمياء الحيوية وعلم الاندماج، كونيسيت – أون سي، قرطبة، الأرجنتين، وغابرييلا فورلان ونويليا مالدونادو على المساعدة في زراعة الخلايا. كما نشكر فيكتور دياز (نائب وزير الاتصالات المؤسسية في FCQ) على إنتاج الفيديو وتحريره.
تم تمويل هذه المقالة من خلال منح من أمانة العلوم والتكنولوجيا ، والجامعة الوطنية في قرطبة (SECyT-UNC) التضامنية 2018-2021 ، و Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ، و Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (جميعها إلى M.C.S.).
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
- Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
- Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
- Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
- Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43 (2017).
- Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
- Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
- Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
- Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199 (2019).
- Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
- Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
- Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
- Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
- Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
- Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
- Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
- Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
- Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
- Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
- Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167 (2019).
- Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357 (2011).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).
