뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화
Summary
여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.
Abstract
산화 환원 균형은 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 반응성 산소 종 (ROS)의 증가된 생성은 단백질, 지질 및 DNA의 변형을 촉진하며, 이는 최종적으로 세포 기능 및 세포 사멸의 변화를 초래할 수 있다. 따라서 세포는 Keap1 / Nrf2와 같은 항산화 경로를 활성화하거나 산화 환원 제거제 (비타민 A, C 및 E, β 카로틴 및 폴리 페놀 등)를 개선함으로써 해로운 모욕에 대한 반응으로 항산화 방어력을 높이는 것이 유익합니다. 염증 및 산화 스트레스는 당뇨병성 망막병증(DR) 및 미숙아 망막병증(ROP)과 같은 망막병증의 병인 및 진행에 관여한다. 뮐러 신경교세포(MGCs)는 신경 망막 조직의 항상성에 중요한 역할을 하기 때문에, 이들은 이러한 세포 보호 메커니즘을 연구하기에 이상적인 모델로 간주됩니다. 이러한 의미에서, 재현 가능하고 간단한 방법으로 ROS 수준을 정량화하는 것은 항산화 세포 방어 메카니즘에 참여하는 경로 또는 분자의 기여도를 평가하는 데 필수적이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용한 ROS 측정 및 MGC의 유세포 분석기를 사용하는 데 필요한 절차에 대한 완전한 설명을 제공합니다. 소프트웨어를 사용한 유세포 분석 데이터 처리를 위한 주요 단계가 여기에 제공되므로 독자는 ROS 수준(FITC의 기하학적 수단)을 측정하고 형광 히스토그램을 분석할 수 있습니다. 이러한 도구는 세포 모욕 후 ROS의 증가뿐만 아니라 세포에 대한 보호 효과를 제공 할 수있는 특정 분자의 항산화 효과를 연구하는 데 매우 유용합니다.
Introduction
신경 망막은 잘 정의 된 신경 층을 제시하는 매우 조직 된 조직입니다. 이들에서, 뉴런 (신경절, amacrine, 양극성, 수평 및 광수용체 세포)은 서로 상호 연결되고 또한 뮐러 아교 세포 (MGCs) 및 성상 세포와 상호 연결되어 시각 정보의 적절한 광전달 및 처리로 이어진다 1,2. MGCs는 전체 망막 절편을 횡단하기 때문에 망막 항상성의 유지에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 여러 보호 과정을 조절하는 모든 세포 유형과 상호 작용할 수 있습니다. MGC는 뉴런에 에너지를 공급하는 당분해, 신경 노폐물의 제거, 신경 전달 물질의 재활용 및 신경 영양 인자의 방출을 포함하여 망막 뉴런의 유지 및 생존을위한 몇 가지 중요한 기능을 가지고 있음이보고되었습니다 3,4,5.
한편, 염증, 산화 및 니트로성 스트레스는 망막병증 6,7,8,9,10,11을 포함한 많은 인간 질환의 발병기전 및 진행에 관여한다. 세포의 산화 환원 균형은 ROS 수준의 엄격한 조절에 달려 있습니다. ROS는 주로 호기성 호흡의 결과로서 생리학적 조건 하에서 지속적으로 생성된다. ROS 패밀리의 주요 구성원은 수퍼옥사이드 음이온(O2͘͘͘͘•-), 히드록실 라디칼(•OH), 다양한 과산화물(ROOR’), 하이드로퍼옥사이드(ROOH), 및 라디칼 없는 과산화수소(H2O2)12,13과 같은 반응성 자유 라디칼을 포함한다. 지난 몇 년 동안, ROS가 필수적인 과정을 조절함으로써 세포에서 중요한 신호 전달 역할을 한다는 것이 명백해졌다. MGCs는 병리학적 조건 하에서 ROS의 과도한 생산을 제거하는 전사 핵 인자 에리스로이드-2 관련 인자 2 (Nrf2) 및 후속 항산화 단백질의 발현의 활성화에 의해 강력한 항산화 방어력을 갖는다14,15,16. ROS의 과장된 생산 또는 ROS를 제거하는 결함이있는 능력으로 인해 세포가 산화 환원 균형을 잃으면 산화 스트레스의 축적은 단백질, 지질 및 DNA의 유해한 변형을 촉진하여 세포 스트레스 또는 사망으로 이어집니다. 망막 항산화 방어 시스템의 증가는 ROP 및 RD17,18,19,20,21,22,23,24와 같은 망막 병증의 해결 및 예방을 향상시킨다. 따라서 ROS 생산을 실시간으로 측정하는 것은 강력하고 유용한 도구입니다.
세포에서 ROS 생산 또는 산화 스트레스를 측정하는 몇 가지 방법이 있습니다. 이 중 2′,7′-디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브는 세포 25,26,27,28의 산화환원 상태를 직접 정량화하는 데 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 이 프로브는 친유성 및 비형광성이다. 세포막을 가로지르는 이 프로브의 확산은 두 개의 에스테르 결합에서 세포내 에스테라제에 의한 절단을 허용하여, 비교적 극성 및 세포막 불투과성 생성물인 2′,7′-디클로로플루오레세인(H2DCF)을 생성한다. 이러한 비형광성 분자는 세포내 축적되고, ROS에 의한 후속 산화는 고도로 형광성 생성물인 DCF를 산출한다. 프로브의 산화는 여러 유형의 ROS (퍼옥시니트라이트, 하이드록실 라디칼, 산화 질소 또는 과산화물)의 작용의 산물이며, 이는 유세포 분석기 또는 공초점 현미경 (530nm에서의 방출 및 485nm에서의 여기)에 의해 검출 될 수 있습니다. 이 기술의 한계는 수퍼옥사이드와 과산화수소가H2 DCF 25,29와 강하게 반응하지 않는다는 것이다. 이 기사에서는 DCFH-DA 프로브를 사용하여 유세포 분석기에 의해 ROS를 측정하고 정량화합니다. 이러한 이유로, 우리는 형광 프로브로 세포를 로딩하기 전에 ROS 유도제 A 또는 B로 MGCs를 자극함으로써 ROS 생산을 유도한다. 또한, 우리는 항산화 화합물을 사용합니다. 마지막으로, 우리는이 프로토콜을 사용하여 얻은 대표적이고 신뢰할 수있는 데이터를 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
암, 염증성 질환, 허혈 / 재관류, 허혈성 심장 질환, 당뇨병 및 망막 병증과 같은 몇 가지 병리학 적 상태와 노화와 같은 생리적 상황은 ROS 과잉 생산 6,7,8,9,10,11로 이어집니다. 따라서, ROS의 조절에 관여하는 경로의 검출, 측정 및 이해는 많은 질병에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 CIBICI의 María Pilar Crespo와 Paula Alejandra Abadie (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina)에게 유세포 측정에 도움을 준 것과 세포 배양 지원을 위해 Gabriela Furlan과 Noelia Maldonado에게 감사하고 싶습니다. 또한 비디오 제작 및 편집에 대한 Victor Diaz (FCQ의 기관 커뮤니케이션 담당 장관)에게 감사드립니다.
이 기사는 Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) 및 Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (모두 M.C.S.)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
Materials
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
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