הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה
Summary
בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג’קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.
Abstract
עוברי דרוזופילה מוקדמים הם תאים גדולים המכילים מגוון עצום של אברונים קונבנציונליים וספציפיים לעובר. במהלך שלוש השעות הראשונות של יצירת העוברים, אברונים אלה עוברים תנועות דרמטיות המופעלות על ידי זרימה ציטופלסמית מבוססת אקטין וסחר מונע על ידי מנוע לאורך מיקרוטובולים. הפיתוח של שפע של בדיקות פלואורסצנטיות קטנות וספציפיות לאברונים (FPs) מאפשר לדמיין מגוון רחב של מבנים שונים המכילים שומנים בכל גנוטיפ, ומאפשר הדמיה חיה ללא צורך בפלואורופור מקודד גנטית. פרוטוקול זה מראה כיצד להזריק צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות לעוברי דרוזופילה כדי לנטר את הסחר באברונים ספציפיים על ידי הדמיה חיה. גישה זו מודגמת על ידי תיוג טיפות שומנים (LDs) ובעקבות תנועתן בתפזורת על ידי וולוצימטריה של תמונת חלקיקים (PIV). פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה מקובלת לחקר אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ומיון, ולמעקב אחר תנועתם של LDs בודדים לאורך מיקרוטובולים. שימוש בצבעים הזמינים באופן מסחרי מביא את היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום. על ידי תיוג משותף של ריבוי של אברונים ו/או יסודות שלדיים באמצעות מיקרו-איניג’קציה, כל המשאבים הגנטיים בדרוזופילה זמינים למחקרי סחר בבני אדם ללא צורך בהחדרת חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. שלא כמו פלואורופורים מקודדים גנטית, בעלי תפוקה קוונטית נמוכה ואקונומיקה בקלות, רבים מהצבעים הזמינים מאפשרים לכידה מהירה ובו זמנית של מספר ערוצים עם תפוקת פוטונים גבוהה.
Introduction
צבעים חיוניים ובדיקות מולקולריות הם כלים רבי עוצמה לדמות מבנים תאיים ספציפיים ואברונים חיים. בעובר Drosophila, אברונים רבים ושונים מציגים לוקליזציה מונעת ציטוסקטון 1,2,3,4, אך היישום של מולקולות קטנות אלה מאתגר מכיוון שקליפת הביצה אטומה לרבים מהם. פרוטוקול זה מתאר שיטה לשימוש בבדיקות פלואורסצנטיות (FPs) בעוברים חיים באמצעות מיקרו-איניג’קציה על מנת לזהות סחר בקנה מידה גדול של אברונים. ההליך כולל הכנת תמיסת ההזרקה, איסוף והכנת ביציות של עוברים, מיקרו-הטמעה, הדמיה וניתוח תמונות.
סידור מרחבי דרמטי של אברונים נפוץ בביצות, ביציות ועוברים רבים של בעלי חיים, בין השאר בגלל גודלם הגדול של תאים אלה. בעובר דרוזופילה , למשל, טיפות שומנים (LDs) ושלפוחיות חלמון נעות לכיוון מרכז העובר רגע לפני התאוליזציה5. תנועה זו תלויה במיקרוטובולים ומשאירה אזור של כ-40 מיקרומטר סביב שולי העובר מרוקנים משני האברונים. בשלבי מחשוף מוקדמים יותר, אברונים רבים מועברים על ידי זרמים ציטופלסמיים המונעים על ידי התכווצויות מבוססות אקטין-מיוזין במשטח העובר6. אף על פי שהעוברים של מינים רבים מפגינים סידור מחדש דומה, עובר דרוזופילה מתאים במיוחד למעקב אחר תהליכים אלה על ידי הדמיה מכיוון שהוא מתפתח חיצונית ב”טמפרטורת החדר” הסטנדרטית במעבדה, הוא שקוף יחסית, קטן מספיק כדי להתאים לרוב מערכי המיקרוסקופ, וניתן לתמרן אותו באמצעות כלים גנטיים רבי עוצמה.
עבור אברונים מסוימים, קיימים חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי המסמנים באופן ספציפי מבנים אלה. לדוגמה, LSD-2 (הידוע גם בשם dPLIN2) הוא חלבון שבעוברים מכוון באופן ספציפי ל-LDs7. קיימים קווי זבובים הנושאים טרנסגנים אינדוקטיביים המקודדים היתוך בין חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו-LSD-28 או מלכודת גנים שבה מוחדר חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) לאזור הקידוד של הגן האנדוגני LSD-2 9,10. עם זאת, לגישה זו יש מגבלות, כולל העובדה שלחלבוני היתוך אלה יש תפוקה קוונטית נמוכה והם נוטים להלבין בקלות. בנוסף, תיוג מספר מבנים שונים בו זמנית יכול להיות מאתגר: עבור אברונים רבים, רק סוג אחד של תג פלואורסצנטי (לעתים קרובות GFP או mCherry) זמין כיום, ולכן הדמיה של שני אברונים בו זמנית עשויה לדרוש טרנסגנים חדשים או החדרות; כמו כן, גם אם קיימים תגים תואמים, החדרתם לזן יחיד יכולה לדרוש צלבים גוזלים זמן רב. זה גם הופך את השימוש במשאבים הגנטיים החזקים הרבים לפחות נוח, למשל, אם שני סמנים אברוניים, נהג Gal4 ומבנה RNAi אינדוקטיבי כולם צריכים להיות נוכחים באותה אם.
באופן עקרוני, ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות שימוש ב-FPs, כולל צבעים חיוניים (למשל, LysoTracker לסימון ליזוזומים), בדיקות מולקולריות (למשל, SiR-tubulin לסימון מיקרוטובולים), ומולקולות ביולוגיות המסומנות בפלואורסצנטיות (למשל, C12 BODIPY כדי לחקור את חילוף החומרים של חומצות שומן11). החל משימוש בתאים בתרבית, הם בדרך כלל מאומתים היטב ככלים רבי עוצמה לחקר הביולוגיה התאית. FPs הם רב-תכליתיים, בעלי תכונות תמונה מעולות ותואמים לחלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לערבב צבעים מרובים וליישם אותם בו זמנית, לעתים קרובות עם היתרונות של הפרדה לאזורים סגולים/כחולים ואדומים רחוקים של הספקטרום ותזוזות סטוקס קטנות, מה שמונע דימום בתעלה. תזוזות סטוקס קטנות מאפשרות לכידה בו-זמנית של ערוצי הדמיה מרובים, ומאפשרות מעקב אחר מספר אברונים בו-זמנית. לבסוף, ניתן ליישם אותם באותה מידה על תיוג אברונים בעוברים של מיני דרוזופילה אחרים או אפילו חרקים אחרים שבהם לא יהיו חלבונים מתויגים באופן פלואורסצנטי.
עם זאת, רוב ה-FPs האלה לא יכולים לחצות את קליפת הביצית המשוכללת של עובר דרוזופילה . הוא מורכב מחמש שכבות: שלוש שכבות כוריוניות חיצוניות (כוריון) המונעות נזק מכני בתוספת שכבת שעווה המקיפה את קרום הוויטלין היוצרת מחסום כימי12. למען הפשטות, השילוב של שכבת השעווה וקרום הוויטלין ייקרא “קרום הוויטלין” שמתחת. כדי לעקוף את קליפת הביצית, פרוטוקול זה מתאים גישה מבוססת של מיקרו-זירת עוברים כדי להכניס FPs לעובר Drosophila . הפרוטוקול מתאר כיצד לנטר את הזרימה הציטופלסמית של LDs בעוברים בשלב המחשוף. הוא כולל הכנת מחטי הזרקה וכלובי איסוף ביצים, תהליך איסוף הביצים והסרה מכנית של הכוריון. זה עובר על איך microinject ותמונה של העוברים וכיצד לנתח את הזרימה הגדולה של LDs באמצעות velocimetry תמונה של חלקיקים (PIV, מותאם מ6). הוא מספק עצות לפתרון בעיות כדי להבטיח את הישרדות העוברים וליצור את המערכת הטובה ביותר להדמיה. כמו כן, נדון כיצד ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לדלם בו זמנית LDs ומיקרוטובולים או ליישם אותו במחקר של אברונים אחרים, כולל ליזוזומים, מיטוכונדריה, שלפוחיות חלמון ורשתית האנדופלסמית (ER).
Protocol
Representative Results
Discussion
עובר דרוזופילה הוא מודל רב עוצמה ונוח לחקר שאלות יסוד בביולוגיה תאית ואורגניסטית. הפשטות היחסית שלו, הגנטיקה החזקה והגודל הקטן שלו הופכים אותה למערכת מצוינת להדמיה הן של תהליכים תאיים והן להתפתחות. כאן, פרוטוקול מיקרו-איניג’קציה סטנדרטי מותאם כדי לאפשר שימוש ב-FP בעוברים. גישה זו מאפשרת הדמיה פלואורסצנטית של מבנים תאיים ספציפיים ללא צורך בפלואורופורים מקודדים גנטית, ופותחת רקעים גנטיים רבים להדמיה. שילוב של צבעים מרובים בתוספת חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי שנבחר באופן אסטרטגי יכולים לפתוח הדמיה חיה רב-ערוצית המשתרעת על פני כל הספקטרום של האור הנראה.
שלבים קריטיים בפרוטוקול:
פרוטוקול זה משתמש ב- BODIPY 493/503 כדי לתייג LDs. ניתן להתאים גישה זו בקלות לסימון מבנים תאיים אחרים. לניתוח תמונה מאוחר יותר, אחד הגורמים החשובים ביותר הוא יחס האות לרעש, כלומר בהירות הצבע בהשוואה לאות הרקע. ליזוזומים צולמו בהצלחה (LysoTracker Red, 1 mM), כמו גם מיטוכונדריה (Mitoview 633, 200 μM), ה-ER (גשש ER Green, 10 μM) והמיקרו-טובולים (SiR tubulin, 200 nM ב-DMSO), כפי שמוצג באיור 2, איור 3, איור 4, איור 5. בנוסף, שלפוחיות חלמון הן אוטו-פלואורסצנטיות ומעבירות אור כחול על עירור UV (תמונה המשתמשת ב-405 ננומטר כאורך הגל של העירור (איור 6)). עבור צבעים אחרים, יש לשאוף שריכוז הצבעים יהיה פי 100-1,000 ממה שיידרש להכתמת תאים בתרבית חיה; זה דומה לריכוז של תמיסת מלאי שתדולל למדיה של תרביות תאים. מכיוון שפרוטוקול זה דורש הזרקה של 100 fL ועובר Drosophila הוא בערך 9 nL בנפח18, ריכוזי הצבעים האלה יהיו בממוצע לריכוז עוברי פנימי של פחות מ-1/100 ממה שנמצא בתקשורת תרביות התאים. באופן זמני, הריכוז המקומי יהיה גבוה יותר באתר ההזרקה, שהוא הרלוונטי ביותר עבור FPs שאינם מתפזרים היטב (כלומר, צבעים מיטוכונדריאליים ו- SiR-tubulin). עבור FPs אלה, התחל בריכוזים הגבוהים המומלצים; אם נצפה מוות בלתי צפוי, מדללים ברצף פי שניים עד שמגיעים לפשרה מקובלת בין הישרדות לעוצמת האות.
בעת הזרקה משותפת של מספר צבעים, שני הצבעים צריכים להיות באותו ממס, או שגם הממסים וגם הצבעים צריכים להיות תואמים לתערובת (ריכוזי אלכוהול העולים על כ-10% אינם מומלצים).
איכות המחטים חיונית להצלחת הליך זה, שכן הקצה צריך להיות בסדר ככל האפשר. אחרת, נזק מפצע ההזרקה עלול לפגוע בהתפתחות הבאה של העובר. מכיוון שמושכי המחטים המסחריים שונים זה מזה, חשוב לעקוב אחר ההצעות של היצרן ולנסות מספר פרמטרים של משיכה עד להשגת הצורה הרצויה. זה קריטי לבצע את שלב בקרת האיכות 1.1.3 מכיוון שעבודה עם קצה מחט סדוק, משונן או משעמם גדול תהפוך את ההזרקה המוצלחת לקשה יותר או אפילו בלתי אפשרית.
יש לייבש את העובר באופן חלקי, כך שניתן יהיה להוסיף כמויות נוספות של נוזלים במהלך ההזרקה. אם העובר לא מיובש מספיק, המחט לא תיכנס בקלות, והציטופלסמה תשפריץ החוצה כשהמחט חודרת או בזמן שהתמיסה מוזרקת. אם העובר מיובש יתר על המידה, הוא ייראה מנופח ולא יתפתח כראוי. זמן הייבוש המדויק תלוי בתנאים המקומיים, למשל, לחות האוויר, ויכול להשתנות מיום ליום. זה צריך להיקבע באופן אמפירי לכל מפגש.
יכולתו של העובר לשרוד לאחר מיקרו-אינציה תלויה באופן קריטי באיכות המחט, בייבוש נכון ובהגבלת נפח ההזרקה לפחות מ-1 pL (באופן אידיאלי 100 fL). כל עוד פרמטרים אלה מותאמים, לא ניכרת רעילות משמעותית כאשר מזריקים את הצבעים המתוארים בריכוזים המומלצים. אם העוברים שורדים את שלבי ההתייבשות וההזרקה, הם בדרך כלל מתפתחים בהצלחה היטב להרחבת רצועת הנבט, יוצאת דופן היא בדיקות המיקרוטובול והמיון שגרמו לפגמים בסלולריזציה ברמות גבוהות (הזרקת 100 fL של ריכוז המלאי של כל אחד מהם). הבדיקה לא מצאה פגמים התפתחותיים ברורים כאשר DMSO, מים ותערובות של השניים הוזרקו בכמויות המומלצות, עם שיעור הישרדות עובר באמצעות הארכת רצועת נבט של כ-75% או יותר. נפחי הזרקה של יותר מ-1 pL גרמו למומים ועוברים שהוזרקו להם כ-4 נפחי pL שפותחו במשך פחות משעה אחת. לכן, נפחי ההזרקה צריכים להישמר נמוכים, מה שאומר שריכוזי הצבע צריכים להיות גבוהים.
בדרך כלל, זריקות לאורך הקצה הצדדי של העובר מומלצות מכיוון שאלו גורמות לנזק הנמוך ביותר. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים את אתר ההזרקה בהתאם לתכונות המפוזרות של ה- FPs המועסקים. BODIPY 493/503 ו-LysoTracker מתפזרים מהר יותר על פני כל העובר מאשר ליפיד ספוט 610 (צבע נוסף לסימון LDs), בעוד ש-SiR-Tubulin ו-Mitoview 633 לעולם אינם מתפזרים במלואם על פני העובר (הדמיה כבר 7 שעות לאחר ההזרקה). לכן, הזרקה באתר העניין או בסמוך לו עשויה להיות נחוצה. בעת הזרקת באזורים הקדמיים או האחוריים, מומלץ מחט עדינה במיוחד.
רכישת תמונה מסתמכת על מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחתוך אופטית ולפתור אברונים קטנים ואת כל רכיבי השלד הציטוסקליים. טכניקות הדורשות ניתוח של תמונות רבות (למשל, STORM או PALM) לא יעבדו מכיוון שהתכולה העוברית נמצאת בתנועה והפלואורופורים אינם מותאמים לצילום. מיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית חסרה את הרזולוציה הצידית והצירית כדי להבחין ברוב האברונים ובמבנים תאיים קטנים יותר. מסיבות אלה, מומלץ מאוד להשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי או להשתמש בטכנולוגיית יריעת אור.
יכולת השחזור של ניתוח התמונה מסתמכת במידה רבה על נתוני הדמיה עקביים. עבור הסיכוי הגדול ביותר להצלחה, נדרש אופטימיזציה של טכניקת ההזרקה ורכישת התמונה. הקמה ותרגול של טכניקה שבה הצבעים המעניינים, אתר ההזרקה, גיל העובר, נפח ההזרקה ומערך הרכישה הם כולם עקביים תיצור את הנתונים החזקים ביותר לניתוח תמונה.
שינויים ופתרון בעיות של השיטה
פרוטוקול זה מדגים שיטה לניתוח הזרימה הגדולה של LDs בעוברים בשלב המחשוף באמצעות ולוצימטריה של תמונת חלקיקים. אותה גישה יכולה לשמש עבור אברונים אחרים, שלבים התפתחותיים אחרים ושיטות ניתוח אחרות. לדוגמה, איור 2 מראה ניתוח של LDs ואברונים חומציים הזורמים בשלבים הסינסיטיאליים של אמבריוגנזה, והודגם על ידי הזרקה משותפת של BODIPY 493/503 ו-LysoTracker Red. הושגה הדמיה מוצלחת נוספת של תנועת LD בעוברים עד 7 שעות לאחר ההפריה; עוברים אלה אכן שומרים על פצע ההזרקה אך מסוגלים להתפתח במשך מספר שעות.
נתונים שנאספו באמצעות פרוטוקול זה שימשו לולוסימטריה של תמונת חלקיקים, אך טכניקות ניתוח רבות אחרות זמינות. לדוגמה, ניתן להשתמש בתוכניות מעקב אחר חלקיקים כמו אלה שנמצאו ב-ImageJ, ב-Imaris או במעקב ידני כדי להשיג מהירויות וכיוונים של מבנים נעים. שים לב שרוב תוכנות המעקב הללו בנויות לעבודה עם נתונים ממערכות תרביות תאים מישוריות ולא תמיד מסתגלות היטב למבנים תלת-ממדיים כמו עובר דרוזופילה . יתר על כן, עבור יצירת נתוני מעקב אחר חלקיקים באיכות הטובה ביותר, יהיה צורך לצלם מספר מישורי Z; זה אמור להיות אפשרי אם זמני רכישת מחסנית התמונות הם מתחת ל~ 2 שניות. אמת מידה זו צריכה להיות נגישה על קונפוקל דיסק מסתובב, יריעת אור סריג, ומערכות קונפוקליות אחרונות לסריקת לייזר. עם זאת, ההיתכנות של מעקב אחר חלקיקים עבור אברונים שופעים כגון LDs, מיטוכונדריה וליזוזומים נמוכה מכיוון שכמות האות החיובי בשדה ראייה גבוהה מדי עבור שיטות המעקב הנוכחיות. מעקב אחר מבנים פחות נפוצים כמו גרעינים או שלפוחיות חלמון עשוי להיות אפשרי. PIV לניתוח זרימה עובד היטב עבור LDs ואברונים חומציים בשלבי מחשוף מכיוון ששני האברונים נעים בחופשיות. אברונים כמו גרעינים, ER ומיטוכונדריה קשורים למבנים תאיים אחרים ולכן אינם נעים בחופשיות ואינם מתאימים לניתוח תוכנה המניח תנועה חופשית. החוקר צריך לבחור את הטכניקות המתאימות ביותר לאברון של העניין.
במהלך שלבי הבלסטודרם הסינסיטיאליים והתאיים, LDs (כמו גם כמה אברונים אחרים) נעים לאורך מיקרוטובולים בעלי אוריינטציה רדיאלית5. לכן ניתן למצוא תצוגות חתך (כמו באיור 5) שבהן מיקרוטובולים בודדים נמצאים במוקד למרחקים ארוכים, מה שמאפשר מעקב אחר חלקיקים בדו-ממד. מכיוון שמישורים אופטיים אלה נמצאים עמוק בתוך העובר, עוצמת האות הכוללת פוחתת, ויחס האות לרעש מצטמצם.
לצורך ניתוח מעקב, הדמיה מהירה ככל האפשר יכולה לחשוף פרטים חיוניים של התנועה וכך של מנגנון תנועתיות. לדוגמה, תנועת ליפיד-טיפה היא תערובת של שני מצבי תנועתיות, תנועה איטית-קצרה (~200 ננומטר לשנייה; מרחק נסיעה ממוצע ~100 ננומטר) ותנועה מהירה-ארוכה (~450 ננומטר לשנייה; מרחק נסיעה ממוצע ~1,000 ננומטר)19; לפיכך, אם התמונות מצולמות כל שנייה או אפילו בתדירות נמוכה יותר, המצב האיטי-קצר הופך לבלתי ניתן לגילוי. עם זאת, הדמיה תכופה גם גורמת להלבנת פלואורופורים ולטוקסיות פוטוטוקסיות. תנאי ההדמיה, אם כן, צריכים להיות מותאמים בהתאם לשאלה המדויקת שיש לטפל בה.
מגבלות השיטה
בהתאם לצבע הרצוי, השיטה יכולה להיות מוגבלת על ידי תאימות בין מסיסות הצבע לבין הרעילות של תמיסת ההזרקה. אלכוהולים כמו איזופרופנול ואתנול קשים לטיפול בתוך מחט בשל צמיגותם הנמוכה יותר ונראה שהם פוגעים במרכיבים התאיים והורגים את העובר.
השיטה גם לא מתאימה לדמיין את הצעדים המוקדמים ביותר באמבריוגנזה מכיוון שלוקח 30+ דקות להכין את העוברים להזרקה. בטמפרטורת החדר, מחזורי התאים ההתחלתיים של העובר הם באורך של כ-10 דקות בלבד כל אחד; לכן, גם אם היו בוחרים ביצית שזה עתה הופרה בשלב 5.2.3, מחזורי התאים הראשונים כבר היו מסתיימים עד שהעובר יהיה מוכן להדמיה.
תאורה עם אור בטווח ה-UV/כחול היא הרבה יותר פוטוטוקסית מאשר באורכי גל ארוכים יותר. בתנאים כאלה (למשל, לעקוב אחר שלפוחיות חלמון אוטופלואורסצנטיות; איור 6), יש להגביל את זמן ההדמיה (מה שמוביל לסדרות זמן קצרות יותר) או להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה יותר (וכתוצאה מכך יחס אות לרעש מופחת).
לאחר התאים, צבעים המוזרקים במיקום מסוים נוטים להתפזר בצורה גרועה, מכיוון שהם חייבים לחצות קרום תאים רבים. זה מגביל את אזור התצפית בשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
ניתן לדמיין את התנועה של LDs ואברונים אחרים המכילים שומנים בעוברים מוקדמים באמצעות פלואורופורים מקודדים גנטית, טכניקות ללא תוויות, ועל ידי הכנסת FPs. זה האחרון יכול להיות מושגת על ידי permeabilization של קרום vitelline12 או את גישת microinjection הנדון כאן.
פלואורופורים המקודדים גנטית הם סמנים רב-תכליתיים שרמותיהם בדרך כלל ניתנות לשחזור גבוה מעובר לעובר. עם זאת, יש להם תפוקות קוונטיות נמוכות יותר ואקונומיקה בקלות רבה יותר מאשר FPs. בדרך כלל, הם זמינים רק בגרסה מתויגת אחת או שתיים (למשל, GFP או mCherry), מה שמגביל את הבחירה אילו מבנים ניתן לצלם בו זמנית. FPs, לעומת זאת, קיימים לעתים קרובות במגוון גדול; לדוגמה, צבעים ספציפיים שונים של טיפות שומנים זמינים עם ספקטרום פליטה מ-Autodot בספקטרום UV/כחול ל-Lipidtox ול-LipidSpot 610 בספקטרום האדום-רחוק. FPs יכולים גם להיות מיושמים ישירות על כל זן בעל עניין, ולכן אינם דורשים בניית מתח כדי, למשל, להכניס את סמן האברונים הרצוי לתוך זן מוטנטי של עניין. יתרון זה בולט במיוחד כאשר יש לסמן מבנים מרובים בו זמנית; במקום צלבים גוזלים זמן רב המתפרשים על פני דורות רבים, ניתן להשיג זאת ביום אחד על ידי ערבוב הצבעים הרלוונטיים והצגתם בו זמנית. לבסוף, אם יש לחקור תהליכים תאיים עם עיכוב פרמקולוגי, ניתן להכניס תרופות וצבעים יחד.
שיטות ללא תוויות הן גישות חזקות מאוד לאיתור מבנים תאיים ספציפיים. לדוגמה, LDs ניתן לזהות באופן ספציפי בעוברים מוקדמים על ידי מיקרוסקופיה דור שלישי הרמוני20 או על ידי femtosecond מגורה Raman Loss מיקרוסקופיה21. בדומה ל-FPs, ניתן ליישם גישות אלה בכל רקע גנטי, ומכיוון שהן אינן גורמות להלבנה, הן עשויות לאפשר רכישת תמונה מהירה יותר. עם זאת, הם בדרך כלל מוגבלים לאברונים ספציפיים ולכן אינם תומכים בעצמם בהדמיית מולטיפלקס; הם גם דורשים מיקרוסקופים מיוחדים.
ישנן שתי אסטרטגיות כלליות להחדרת מולקולות קטנות לעוברים. האחת היא גישת המיקרו-איניג’מנט הנהוגה כאן; השני הוא טיפול כימי (טרפן) כדי לחדור את קרום vitelline. הגישה האחרונה12 פחות מעורבת ממיקרו-אינקציה, אך גם משתנה יותר מעובר לעובר. בנוסף, לאחר חלחול, ההגנה שמספקת קרום הוויטלין נפגעת והעובר הנכון נגיש למדיום החיצוני, מה שמקשה עליו יותר לשמור עליו בחיים. מיקרו-איניג’קציה נוטה הרבה פחות לשבש התפתחות עוברית מאשר חדירה. עם זאת, חלחול מומלץ אם יש צורך במעקב אחר עוברים רבים בו זמנית, למשל למטרות בדיקת סמים. כדי לעקוב אחר התנועה של מבנים תאיים ולהשיג סדרות תמונות הניתנות לשחזור המתאימות לניתוח תמונה, מיקרו-איניג’קציה היא שיטת הבחירה.
חשיבות ויישומים פוטנציאליים של השיטה בתחומי מחקר ספציפיים
עובר דרוזופילה הוא מודל חשוב לחקר תהליכים תאיים-ביולוגיים והתפתחותיים רבים 1,5,6. תיוג אברונים עם חלבונים פלואורסצנטיים תרם תרומה משמעותית להבנת האופן שבו העובר המוקדם מתפתח, כיצד תנועה של אברונים שונים, וכיצד סחר כזה מווסת מבחינה התפתחותית וגנטית. עם זאת, הנטייה שלהם להלבין והאתגרים של יצירת זנים שבהם אברונים מרובים מסומנים בצבעים שונים מגבילים את היישום של גישה זו. השימוש ב-FPs שהוכנסו על-ידי מיקרו-אינדקציה פותר רבים מהאתגרים הללו ואף ניתן לשלב אותו עם חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של אברונים מרובים, מבני תאים ורכיבי שלד ציטוסקטליים בכל רקע גנטי. כתוצאה מכך, ניתן להשוות מספר גנוטיפים באמצעות הדמיה חיה, מה שמאפשר לקבוע את השפעת המוטציות על הסחר באברונים מרובים.
פרוטוקול זה מדגים את גישת הזרקת ה-FP לעוברים של Drosophila melanogaster, אך באופן עקרוני, גישה זו חלה על כל ביצי חרקים שעבורם נקבעו טכניקות מיקרו-החדרה, כולל מינים אחרים של דרוזופילה, צרצרים22 וכנימות23.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפאקיני פרומסירי, בריאן ג’נצ’יק, ג’ינגהונג (ג’יימס) טאנג ורוג’ר וייט על הערותיהם על כתב היד. אנו מודים לפטריק אוקס, סטפנו די טליה וויקטוריה דנקה על שיתוף המומחיות שלהם כיצד לבצע ניתוח PIV. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות F31 HD100127 (ל- M. D. K.) ו- R01 GM102155 (ל- M. A. W).
Materials
| AUTODO | abcepta | SM1000a | Stains lipid droplets in violet/blue |
| BODIPY 493/503 | ThermoFisher | D3922 | Stains lipid droplets in green |
| Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite | W.A. Hammond Drierite Company | 21001 | |
| Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base | Zeiss | 4350030000000000 | |
| Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape | Scotch (3M) | – | Sold by many vendors |
| ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide) | ThermoFisher | E34251 | Stains the ER/nuclear envelope |
| Femptotip II | Eppendorf | H129354N | Ready to use |
| Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in | World Precision Instruments | TW100F-4 | Must be pulled |
| Glass coverslip | – | – | Buy the appropriate refractive index for your objective lens |
| Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned | FisherBrand | 12-550-343 | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | |
| Heptane greener alternative anhydrous, 99% |
Sigma-Aldrich | 246654-1L | Heptane is considered toxic by the USA's OSHA |
| Confocal microscope | Leica | Sp5 | Many different types of confocal microscopes will work. |
| LipidSpot 610 | Biotium | #70069 | Stains lipid droplets in far red |
| LysoTracker Red | ThermoFisher | L7528 | Stains lysosomes in red |
| MitoView 633 | Biotium | #70055 | Stains mitochondria |
| Needle loading pipette tips – 20uL microloader tips | Eppendorf | # 5242956.003 | |
| P-1000, Next Generation Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1×1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip. |
| SiR-Tubulin | Cytosketon Inc | CY-SC014 | Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red |
| TransferMan | Eppendorf | 5178 NK | |
| ViaFluor 405 | Biotium | #70064 | Stains microtubules in violet/blue |
References
- Chowdhary, S., Tomer, D., Dubal, D., Sambre, D., Rikhy, R. Analysis of mitochondrial organization and function in the Drosophila blastoderm embryo. Scientific Reports. 7 (1), 5502 (2017).
- Mavor, L. M., et al. Rab8 directs furrow ingression and membrane addition during epithelial formation in Drosophila melanogaster. Development. 143 (5), 892-903 (2016).
- Riggs, B., et al. Actin cytoskeleton remodeling during early Drosophila furrow formation requires recycling endosomal components Nuclear-fallout and Rab11. Journal of Cell Biology. 163 (1), 143-154 (2003).
- Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics. Cell. 92 (4), 547-557 (1998).
- Welte, M. A. As the fat flies: The dynamic lipid droplets of Drosophila embryos. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (9), 1156-1185 (2015).
- Deneke, V. E., et al. Self-organized nuclear positioning synchronizes the cell cycle in Drosophila embryos. Cell. 177 (4), 925-941 (2019).
- Welte, M. A., et al. Regulation of lipid-droplet transport by the perilipin homolog LSD2. Current Biology. 15 (14), 1266-1275 (2005).
- Bailey, A. P., et al. Antioxidant role for lipid droplets in a stem cell niche of Drosophila. Cell. 163 (2), 340-353 (2015).
- Johnson, M. R., et al. H2Av buffering via dynamic sequestration to lipid droplets in Drosophila embryos. Elife. 7, 36021 (2018).
- Lowe, N., et al. Analysis of the expression patterns, subcellular localisations and interaction partners of Drosophila proteins using a pigP protein trap library. Development. 141 (20), 3994-4005 (2014).
- Rambold, A. S., Cohen, S., Lippincott-Schwartz, J. Fatty acid trafficking in starved cells: regulation by lipid droplet lipolysis, autophagy, and mitochondrial fusion dynamics. Developmental Cell. 32 (6), 678-692 (2015).
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).
- Tran, S. L., Welte, M. A. In-vivo centrifugation of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo collection. CSH Protocols. 2007, (2007).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Roberts, D. B. . Drosophila: A Practical Approach. , 179-214 (1998).
- . The Interactive Fly: Stages of Development and Mitotic Domains Available from: https://www.sdbonline.org/sites/fly/aimain/2stages.htm (1999)
- Liberzon, A., et al. . OpenPIV/openpiv-python: OpenPIV – Python (v0.22.2) with a new extended search PIV grid option. , (2020).
- Markow, T. A., Beall, S., Matzkin, L. M. Egg size, embryonic development time and ovoviviparity in Drosophila species. Journal of Evolutionary Biology. 22 (2), 430-434 (2009).
- Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Dynein-mediated cargo transport in vivo. A switch controls travel distance. Journal of Cell Biology. 148 (5), 945-956 (2000).
- Debarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nature Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
- Dou, W., Zhang, D., Jung, Y., Cheng, J. X., Umulis, D. M. Label-free imaging of lipid-droplet intracellular motion in early Drosophila embryos using femtosecond-stimulated Raman loss microscopy. Biophysical Journal. 102 (7), 1666-1675 (2012).
- Barry, S. K., et al. Injecting Gryllus bimaculatus Eggs. Journal of Visualized Experiments. (150), (2019).
- Le Trionnaire, G., et al. An integrated protocol for targeted mutagenesis with CRISPR-Cas9 system in the pea aphid. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 110, 34-44 (2019).
