使用光敏转移素对活体植入前小鼠胚胎中的微管细胞骨架进行时空亚细胞操作
Summary
典型的微管抑制剂广泛用于基础和应用研究，对细胞具有深远的影响。最近，光敏素作为一类光开关微管抑制剂出现，能够对微管进行瞬时，可逆，时空精确操作。该分步实验方案详细介绍了迁光素在3D活体植入前小鼠胚胎中的应用。
Abstract
微管细胞骨架形成细胞的框架，是细胞内运输、细胞分裂和信号转导的基础。例如，使用诺考达唑对无处不在的微管网络进行传统的药理学破坏可能对任何细胞产生破坏性后果。可逆光开关微管抑制剂有可能通过使药物效应能够以时空控制的方式实现来克服局限性。其中一个这样的药物家族是基于偶氮苯的光敏类药物（PST）。这些化合物在黑暗条件下是无活性的，并且在用紫外光照射时，它们与β微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合并阻断微管聚合和动态周转。在这里，PST在3维（3D）活体植入前小鼠胚胎中的应用旨在亚细胞水平上破坏微管网络。该协议提供实验设置的说明，以及使用活细胞共聚焦显微镜的PST的光激活和失活参数。这确保了可重复性，并使其他人能够将此程序应用于他们的研究问题。像PST这样的创新型光开关可以发展成为促进对动态细胞内微管网络的理解并实时非侵入性地操纵细胞骨架的强大工具。此外，PST可能被证明在其他3D结构中有用，例如类器官，胚泡或其他物种的胚胎。
Introduction
微管结构在不同细胞类型之间差异很大，以支持不同的功能1，2。其生长和收缩的动态性质允许快速适应细胞外和细胞内线索，并响应细胞不断变化的需求。因此，它可以被认为是在细胞身份中起关键作用的“形态指纹”。
使用小分子抑制剂对微管细胞骨架进行药理靶向已导致发育生物学，干细胞生物学，癌症生物学和神经生物学中的大量基本发现3，4，5，6，7。这种方法虽然不可或缺，但存在各种局限性，例如毒性和脱靶效应。例如，使用最广泛的微管靶向剂之一诺考达唑是一种强大的微管解聚药物8。然而，诺考达唑等小分子抑制剂从应用时起就具有活性，并且鉴于微管细胞骨架对许多关键细胞功能的必要性质，微管的全局解聚可以产生脱靶效应，这可能不适用于许多应用。此外，除非样品洗涤不含药物，否则诺考达唑治疗是不可逆的，从而阻止连续的实时成像，从而防止精确跟踪单个微管丝。
光激活化合物的发展始于光辐射分子的产生，并预示着以精确和时空控制的方式靶向和监测微管生长抑制效果的新时代。一个可逆光开关药物家族，光刺激素（PST），是通过用偶氮苯9代替康布雷他汀A-4的二苯乙烯成分而开发的。PST在用紫外光照明之前处于非活性状态，其中非活性 转化构型通过可逆异构化转换为有源 顺式构型。 顺式-PST通过与秋水仙碱结合位点β-微管蛋白结合，阻断其与β微管蛋白的界面并防止微管生长所需的二聚反应来抑制微管聚合10。在一组PST中，PST-1P已成为一种先导化合物，因为它具有最高的效力，是完全水溶性的，并且在照明后显示出快速的生物活性。
PST最有效的 反式到 顺式异构化发生在360-420nm之间的波长处，这为PST活化提供了双重选择。可以在典型的共聚焦显微镜上施用405nm激光线，以实现微管生长抑制的最佳空间靶向。通过405 nm激光照明精确定位PST激活的位置和时间的能力有助于精确的时间和空间控制，允许在亚细胞水平上破坏微管动力学，在亚秒级响应时间内9。或者，经济实惠的LED紫外光允许整个生物体照明诱导生物体范围的微管结构破坏。对于研究人员来说，这可能是一种具有成本效益的替代方案，对他们来说，目标是精确定时的抑制发作，而不是空间靶向。PST的另一个特点是通过施加510-540nm范围内波长的绿光9来按需灭活。这样可以在PST介导的生长抑制之前，期间和之后追踪微管丝。
PST虽然仍然是一个相对较新的设计，但已被用于不同研究领域的许多体外应用11，包括研究变性腺细胞迁移的新机制12，从新生小鼠大脑中分离的神经元13，以及黑腹果蝇的翅膀上皮发育14.其他光反应药物已被证明是靶向破坏细胞功能的宝贵工具。例如，blebbistatin的类似物，azidoblebbistatin，用于在照明15，16下增强肌球蛋白抑制。这突出了由于时空控制抑制细胞功能的能力而具有新发现的潜力。
活的3D生物体呈现出精湛而又更精细的系统，可在生理条件下操纵整个动物，单细胞或亚细胞水平上的微管动力学。特别是，植入前小鼠胚胎为细胞的内部运作以及生物体内的细胞间关系提供了非凡的洞察力17。PST的激活和失活的时间和空间靶向连续循环有助于表征相间桥，即细胞之间的细胞动力学后结构，作为植入前小鼠胚胎16中的非中心体微管组织中心。类似的实验装置表明，生长的微管参与小鼠胚胎的密封以允许囊胚形成18。此外，PSTs还用于整个斑马鱼胚胎，通过抑制后脑19中一个细胞亚群中的微管生长来研究神经元细胞迁移。
该协议描述了PST-1P在植入前小鼠胚胎中的实验设置和使用。这里给出的说明还可以指导PST在各种目标中的应用，例如研究染色体分离和细胞分裂，细胞内货物的运输以及细胞形态发生和迁移。此外，这些研究将有助于在类器官系统，胚泡和其他胚胎模型中实施PST，如 秀丽隐杆线虫 和 非洲爪蟾，并可能扩大PST 在体外 受精技术中的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
微管网络是细胞基本内部运作的组成部分。因此，这为操纵生物体中的微管动力学带来了挑战，因为对网络的任何扰动往往对细胞功能的各个方面产生广泛的影响。光开关微管靶向化合物的出现提供了一种在亚细胞水平上精确操纵细胞骨架的方法，对微管生长抑制的诱导和逆转具有卓越的控制力9。该协议展示了如何在植入前小鼠胚胎中通过光激活的PST-1P在亚细胞尺度上以时间精…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Oliver Thorn-Seshold博士和Li Gao博士为我们提供的摄影素和手稿准备建议，Monash Production提供拍摄支持，Monash Micro Imaging提供显微镜支持。
这项工作得到了国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）项目赠款APP2002507对J.Z.和加拿大高级研究所（CIFAR）Azrieli奖学金对J.Z.的支持。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府的赠款支持。
Materials
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | For mouth aspiration apparatus |
| Chamber slides – LabTek | Thermo Fisher Scientific | NUN155411 | |
| cRNA encoding for EB3-dTomato | N/A | N/A | Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit |
| Culture dishes – 35mm | Thermo Fisher Scientific | 150560 | |
| Human chorionic growth hormone | Sigma-Aldrich | C8554 | |
| Human Tubal Fluid (HTF) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B071 | |
| Imaris Image Analysis Software | Bitplane | ||
| Immersion Oil W 2010 | Carl Zeiss | 444969-0000-000 | For use with microscope immersion objective |
| LED torch – Red light | Celestron | 93588 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Mice – wild-type FVB/N, males and females | N/A | N/A | Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old. |
| Microcapillary Pipettes – Kimble | Sigma-Aldrich | Z543306 | For mouth aspiration apparatus |
| Microinjection buffer | N/A | N/A | 5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4 |
| Mineral oil | Origio | ART-4008-5P | |
| mMessage In vitro Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1340 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium | Cosmo-Bio | CSR-R-B074 | |
| Pregnant mare serum gonadotrophin | Prospec Bio | HOR-272 | |
| PST-1P | N/A | N/A | Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015). |
| RNA purification kit | Sangon | B511361-0100 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | W1503 | |
| ZEN Black Software | Carl Zeiss |
References
- Hawdon, A., Aberkane, A., Zenker, J. Microtubule-dependent subcellular organisation of pluripotent cells. Development. 148 (20), (2021).
- Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
- Galli, M., Morgan, D. O. Cell size determines the strength of the spindle assembly checkpoint during embryonic development. Developmental Cell. 36 (3), 344-352 (2016).
- Vazquez-Diez, C., Paim, L. M. G., FitzHarris, G. Cell-size-independent spindle checkpoint failure underlies chromosome segregation error in mouse embryos. Current Biology. 29 (5), 865-873 (2019).
- Baudoin, J. P., Alvarez, C., Gaspar, P., Metin, C. Nocodazole-induced changes in microtubule dynamics impair the morphology and directionality of migrating medial ganglionic eminence cells. Developmental Neuroscience. 30 (1-3), 132-143 (2008).
- Munz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
- Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nature Reviews Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Borowiak, M., et al. Photoswitchable inhibitors of microtubule dynamics optically control mitosis and cell death. Cell. 162 (2), 403-411 (2015).
- Gaspari, R., Prota, A. E., Bargsten, K., Cavalli, A., Steinmetz, M. O. Structural basis of cis- and trans-Combretastatin binding to tubulin. Chem. 2 (1), 102-113 (2017).
- Thorn-Seshold, O., Meiring, J. Photocontrolling microtubule dynamics with photoswitchable chemical reagents. ChemRxiv. , (2021).
- Kopf, A., et al. Microtubules control cellular shape and coherence in amoeboid migrating cells. Journal of Cell Biology. 219 (6), 201907154 (2020).
- Sawada, M., et al. PlexinD1 signaling controls morphological changes and migration termination in newborn neurons. The EMBO Journal. 37 (4), 97404 (2018).
- Singh, A., et al. Polarized microtubule dynamics directs cell mechanics and coordinates forces during epithelial morphogenesis. Nature Cell Biology. 20 (10), 1126-1133 (2018).
- Kepiro, M., et al. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (24), 9402-9407 (2012).
- Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
- White, M. D., Zenker, J., Bissiere, S., Plachta, N. Instructions for assembling the early mammalian embryo. Developmental Cell. 45 (6), 667-679 (2018).
- Zenker, J., et al. Expanding actin rings zipper the mouse embryo for blastocyst formation. Cell. 173 (3), 776-791 (2018).
- Theisen, U., et al. Microtubules and motor proteins support zebrafish neuronal migration by directing cargo. Journal of Cell Biology. 219 (10), 201908040 (2020).
- Rulicke, T. Pronuclear microinjection of mouse zygotes. Methods in Molecular Biology. 254, 165-194 (2004).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio-protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Subramanian, G. N., et al. Oocytes mount a noncanonical DNA damage response involving APC-Cdh1-mediated proteolysis. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201907213 (2020).
- Mihajlovic, A. I., Bruce, A. W. The first cell-fate decision of mouse preimplantation embryo development: integrating cell position and polarity. Open Biology. 7 (11), 170210 (2017).
- Roostalu, J., et al. The speed of GTP hydrolysis determines GTP cap size and controls microtubule stability. Elife. 9, 51992 (2020).
- Gao, L., et al. In vivo photocontrol of microtubule dynamics and integrity, migration and mitosis, by the potent GFP-imaging-compatible photoswitchable reagents SBTubA4P and SBTub2M. BioRxiv. bioRxiv. , (2021).
- Tichy, A. M., Gerrard, E. J., Legrand, J. M. D., Hobbs, R. M., Janovjak, H. Engineering strategy and vector library for the rapid generation of modular light-controlled protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3046-3055 (2019).
- van Haren, J., Adachi, L. S., Wittmann, T. Optogenetic control of microtubule dynamics. Methods in Molecular Biology. 2101, 211-234 (2020).
- Adikes, R. C., Hallett, R. A., Saway, B. F., Kuhlman, B., Slep, K. C. Control of microtubule dynamics using an optogenetic microtubule plus end-F-actin cross-linker. Journal of Cell Biology. 217 (2), 779-793 (2018).
- Kogler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Developmental Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Bukhari, S. N. A., Kumar, G. B., Revankar, H. M., Qin, H. L. Development of combretastatins as potent tubulin polymerization inhibitors. Bioorganic Chemistry. 72, 130-147 (2017).
- Gilazieva, Z., Ponomarev, A., Rutland, C., Rizvanov, A., Solovyeva, V. Promising applications of tumor spheroids and organoids for personalized medicine. Cancers (Basel). 12 (10), 2727 (2020).
- Scherer, K. M., et al. Three-dimensional imaging and uptake of the anticancer drug combretastatin in cell spheroids and photoisomerization in gels with multiphoton excitation. Journal of Biomedical Optics. 20 (7), 78003 (2015).
