Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto
Summary
Capaz de recuperação funcional após lesão medular, o zebrafish adulto é um sistema modelo de elucidar mecanismos inatas de regeneração neural. Aqui, descrevemos a resistência à natação e os ensaios de comportamento de natação como leituras funcionais da regeneração da medula espinhal.
Abstract
Devido à sua renomada capacidade regenerativa, os zebrafish adultos são um modelo de vertebrado premier para interrogar mecanismos de regeneração da medula espinhal inata. Após a transeção completa de sua medula espinhal, os zebrafish estendem pontes glial e axonal através do tecido cortado, regeneram neurônios proximal à lesão e recuperam suas capacidades de natação dentro de 8 semanas de lesão. A recuperação da função de natação é, portanto, uma leitura central para a reparação funcional da medula espinhal. Aqui, descrevemos um conjunto de ensaios comportamentais para quantificar a capacidade motora de zebrafish dentro de um túnel de natação fechado. O objetivo desses métodos é fornecer medidas quantificáveis de resistência à natação e comportamento de natação em zebrafish adultos. Para a resistência ao nado, os zebrafish são submetidos a uma velocidade de corrente de água em constante aumento até a exaustão, e o tempo de exaustão é relatado. Para avaliação do comportamento de natação, os zebrafish são submetidos a velocidades de baixa corrente e vídeos de natação são capturados com uma visão dorsal dos peixes. Por cento de atividade, frequência de explosão e tempo gasto contra a corrente de água fornecem leituras quantificáveis do comportamento de natação. Quantificamos a resistência ao nado e o comportamento de natação em zebrafish tipo selvagem antes da lesão e após a transeção da medula espinhal. Descobrimos que os zebrafish perdem a função de natação após a transeção da medula espinhal e gradualmente recuperam essa capacidade entre 2 e 6 semanas após a lesão. Os métodos descritos neste estudo poderiam ser aplicados a estudos neuroabáviois, musculoesqueléticos, regeneração muscular esquelética e regeneração neural em zebrafish adulto.
Introduction
Os zebrafish adultos são eminentemente usados para investigar mecanismos de desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético e modelagem de doenças1,2,3. Os zebrafish são capazes de reparar eficientes e espontâneos tecidos múltiplos, incluindo cérebro, medula espinhal e músculo esquelético4,5,6,7. A notável capacidade de regenerar tecidos neuromusculares e doenças modelo está atraindo uma comunidade científica crescente para pesquisas de zebrafish adulto1,2,3. No entanto, enquanto ensaios de locomoção e comportamento de natação estão disponíveis e padronizados para zebrafish larval, há uma necessidade crescente de desenvolver protocolos análogos em peixes adultos8,9,10,11. O objetivo deste estudo é descrever protocolos para quantificar a resistência à natação e o comportamento de natação em zebrafish adultos. Apresentamos esses protocolos no contexto da pesquisa de regeneração da medula espinhal. No entanto, os protocolos comportamentais descritos aqui são igualmente aplicáveis aos estudos de regeneração neural e muscular, desenvolvimento neuromuscular e musculoesquelético, bem como modelagem de doenças neuromusculares e musculoesqueléticos.
Zebrafish reverte paralisia dentro de 8 semanas de transeção completa da medula espinhal. Ao contrário dos mamíferos mal regenerativos, os zebrafish apresentam respostas de lesões imuno regenerativas, neuronais e glial que são necessárias para a reparação funcional da medula espinhal12,13,14. Uma leitura final da reparação funcional da medula espinhal é a capacidade do tecido lesado de recuperar sua função após a lesão. Um conjunto de métodos padronizados para avaliar a regeneração funcional em roedores inclui testes locomotor, motor, sensorial e sensorial15,16,17. Testes amplamente utilizados na lesão medular do rato incluem a escala de rato de basso locomotor (BMS), testes motores de membros dianteiros, testes sensoriais táteis e testes sensorimotores de caminhada na grade15,17. Em contraste com os sistemas de zebrafish mamíferos ou larvais, os testes comportamentais em zebrafish adultos são menos desenvolvidos, mas muito necessários para acomodar as crescentes necessidades das comunidades de regeneração tecidual e modelagem de doenças.
Transeções completas da medula espinhal resultam em paralisia completa caudal para o local da lesão. Logo após a lesão, os animais paralisados são menos ativos e evitam nadar o máximo possível. Para compensar a perda da capacidade de natação, os animais paralisados apresentam rajadas curtas e frequentes, usando demais suas barbatanas peitorais, que ficam rostral à lesão. Esta estratégia de natação compensatória resulta em exaustão rápida e menor capacidade de natação. À medida que a medula espinhal dos zebrafish se regenera, os animais recuperam uma função de natação oscilante suave caudal para a lesão, permitindo maior resistência à natação e melhores parâmetros de comportamento na natação. Aqui, descrevemos métodos para quantificar a resistência ao nado de zebrafish no aumento das velocidades de corrente de água e comportamento de natação em velocidades de baixa corrente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os zebrafish adultos são um sistema de vertebrados popular para modelar doenças humanas e estudar mecanismos de regeneração tecidual. A edição do genoma CRISPR/Cas9 revolucionou estudos genéticos reversos para modelagem de doenças em zebrafish; no entanto, a genética em larga escala em zebrafish adulto tem sido dificultada por desafios biológicos e técnicos, incluindo a indisponibilidade de tecidos adultos de zebrafish para fenotipagem de alto rendimento. Dada a complexa anatomia dos zebrafish adultos, o proce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Recurso Compartilhado de Zebrafish da Universidade de Washington pelo cuidado com os animais. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH (R01 NS113915 a M.H.M.).
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
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