Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

Laboratuvar hayvanları kullanılarak yapılan tüm deneyler Nara Bilim ve Teknoloji Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile gerçekleştirildi. Araştırmacılar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal ve ulusal hayvan düzenleme komiteleri tarafından belirlenen yönergelere uymalıdır. 1. Çözümlerin ve medyanın hazırlanması Ek Dosya 1’de özetlenen çözümleri ve kültür medyasını hazırlayın 2. Poli-D lizin (PDL)/laminin kaplı substratların hazırlanması Fosfat tamponlu salinde (PBS, pH 7.4) çözünmüş 100 μg/mL PDL ile 14 mm çapında cam tabanlı bulaşıkları kaplar ve 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde bir gece kuluçkaya yatırın.NOT: Bu adımdan sonra cam yüzeyleri kurutmayın PDL çözeltisini ve pipeti 1 mL PBS’yi cam üzerinde üç kez 10 sn çıkarın. Yemekleri PBS’de çözünmüş 5 μg / mL laminin ile kaplayın ve 37 ° C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde bir gece kuluçkaya yatın. Laminin çözeltisini ve pipeti 1 mL PBS’yi camda üç kez 10 sn çıkarın. PBS’yi çıkarın ve nörobakal ortamın 0,5 mL’lik kısmını cam yüzeylere yerleştirin. Bulaşıkları 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde saklayın.NOT: PDL/laminin kaplı yemekler 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2-3 gün saklanabilir. 3. Hipokampüsün diseksiyonu ve ayrışması Hamile bir fareyi servikal çıkık ile ötenazi.NOT: Bu çalışmada piyasada bulunan fareler sunulmuştur (bkz. Malzeme Tablosu). Araştırmacılar sterilize edilmiş bir ortamda yetiştirilen ve insanca tedavi edilen fareleri kullanmalıdır. Embriyonik gün-16 (E16) fare embriyolarını parçalara ayrıştırıp buza yerleştirin. Laminer akış davlumbazında, beyinleri makasla parçalara ayrıştırın ve 10 mL buz gibi diseksiyon çözeltisi içeren steril 10 cm’lik bir kabın üzerine yerleştirin. Diseksiyon stereo mikroskobu ile, serebral yarımkürelerin menenjilerini dikkatlice soyun ve ardından hipokampiyi empeps kullanarak parçalara ayrıştırın. Hipokampiyi 15 mL’lik bir tüpte 5 mL buz gibi sindirim çözeltisine aktarın. Hipokampiyi 37 °C’de 20 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya yatırın. Sindirim çözeltisini çıkarın ve 3 mL diseksiyon çözeltisi ekleyin. Hipokampiyi pasteur pipetle dört kez hafifçe pipetle. Hipokampiyi 37 °C’de 20 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonu 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Ayrışmayan dokuya 3 mL yeni diseksiyon çözeltisi ekleyin. Hipokampi tamamen dağılana kadar 3.7-3.9 arası adımları tekrarlayın. Pasteur pipetle dönerek ve aspire ederek hücre süspansiyonundan yüzen DNA agregalarını çıkarın. Hücre süspansiyonu 180 x g’da 4 °C’de 20 dakika santrifüj.NOT: Hasarlı hücrelerden elde edilen DNA santrifüjleme işlemini bozacaktır. Nöronlar süpernatanta kalırsa, DNA’yı dikkatlice çıkardıktan sonra hücre süspansiyonu tekrar santrifüjleme. %5 CO2 ile 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde fetal sığır serumu (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) içeren eşkenar nörobakal ortam. 4. Transfeksiyon ve kült nöronlar Süpernatant çıkarın ve 50 mL tüp içine 5 mL buz gibi PBS ekleyin. Hücre peletini hafif pipetleme ile yeniden dürt. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, % 0,5 trippan mavi çözeltisinin 10 μL’sini ekleyin ve ardından hemositometre ile hücre sayısını sayın. Hücre süspansiyonu 50 mL tüpte 180 x g’da 4 °C’de 20 dakika santrifüj. Bu arada, transfeksiyon için aliquot, 1 x 106 hücre başına 1 μg pFN21A-HaloTag-actin ve 3 μg pmNeonGreen-N1-Lifeact, bir mikrosantrifüj tüpüne. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve 50 mL’lik boruya 100 μL elektroporasyon ortamı (transfeksiyon kiti tarafından sağlanır) ekleyin. Hücre peletini pipetleme ile yeniden dirildi. Hücre süspansiyonunu aliquoted DNA çözeltisi ile karıştırın ve karışımı bir cuvette ‘e (transfeksiyon kiti tarafından sağlanır) aktarın.NOT: Hava kabarcıkları elektroporasyonunu bozduğundan, hücre süspansiyonundan çıkarın. Cuvette’i elektroporasyon aparatına (Malzeme Tablası) yerleştirin ve O-005 programını kullanarak elektroporasyon gerçekleştirin. Cuvette’e hemen FBS, penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) içeren önceden ısıtılmış ve dengelenmiş nörobakal ortamın 1 mL’sini ekleyin. Hücre süspansiyonunu plastik bir pipet kullanarak (transfection kiti tarafından sağlanan) 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini bir mikrotüpe aktarın, % 0,5 trippan mavi çözeltisinin 10 μL’sini ekleyin ve ardından hemositometre ile hücre sayısını sayın. PDL/laminin kaplı cam tabanlı tabakları inkübatörden çıkarın ve nörobakal ortamı çıkarın. Pipet Çanak başına 2.0 x 105 hücre içeren hücre süspansiyonunun 0.5 mL’si ve 37 °C’de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3 saat boyunca% 5 CO2 ile kuluçkaya yaslayın. Ortamı %2 B-27 takviyesi, glutamin (1 mM), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) içeren 0,5 mL nörobakal ortamla değiştirin. Nöronları% 5 CO2 ile 37 ° C’de 3 gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde kültüre edin. 5. Nöronal büyüme konilerde tek benekli görüntüleme Gün in vitro (DIV) 3, kültür ortamında 1:2000 seyreltme seyreltme tetrametril-rhodamin (TMR) ligand ile nöronları tedavi. %5 CO2 ile nöronları 37 °C’de 1 saat koruyun. TMR ligandını önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın. %2 B-27 takviyesi, glutamin (1 mM), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) içeren ısıtılmış Leibovitz’in L-15 ortamının PBS ve pipetini 0,5 mL çıkarın. Nöronları 37 °C’de 1 saat koruyun. Epifluoresans mikroskobu açın ve sahne üstü inkübatörü 37 °C’ye ayarlayın.NOT: Mevcut protokolde tamamlayıcı metal oksit yarı iletken kamera, 100x/1.40 NA yağ daldırma objektif lens, cıva lambası ve görüntü alma yazılımı ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu sunulmuştur (bkz. Bu analiz için eşdeğer spesifikasyonlara sahip diğer epifluoresans mikroskopları da kullanılabilir. TMR ligand ile işlenmiş nöronları ısıtılmış sahne üstü inkübatörün üzerine cam tabanlı tabağa yerleştirin. Görüntü alma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: pozlama süresi, Lifeact ve HaloTag-actin floresan kanalları için 500 ms; binning, 1 x 1 (0,065 μm × piksel başına 0,065 μm); zaman aralığı, 3 s; süre, 50 kare. Lifeact’i güçlü bir şekilde ifade eden ve HaloTag-actin’i zayıf bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçin.NOT: Lifeact ifadesi büyüme konisi morfolojisini görselleştirecek kadar güçlü olmalıdır. HaloTag-actin ekspresyonu zayıf ve tespit edilememeli (Şekil 2A). Floresan protein ekspresyonlarının seviyeleri transfeksiyon için DNA miktarı değiştirilerek ayarlanabilir. Büyüme konisini içeren minimum alanı aydınlatmak için diyafram alanını kapatın (Şekil 2B).NOT: Minimum alanın aydınlatılması arka plan sinyalini azaltır ve floresan sinyalini gürültüye (S/N) oranına yükselterek akin beneklerinin algılanmasını sağlar (Şekil 2B). S/N oranını daha da artırmak için, ışığı nötr yoğunluk filtreleriyle azaltmadan büyüme konisinin aydınlattırı önerilir. Zaman atlamalı görüntüler alın (Ek Dosya 2). Çok kanallı zaman atlamalı yığın görüntüsü (tiff biçimi) olarak kaydedin. 6. Bir görüntü işleme ve analiz yazılımı fiji kullanarak F-actin akış hızı ve polimerizasyon oranının nicelleştirilmesi NOT: F-actin akış hızını ve aktin polimerizasyon oranını ölçmek için uygulama verileri için Ek Dosya 3’e bakın. Fiji’de çok kanallı zaman atlamalı yığın görüntüsünü açın. Ölçeği > Ayarla’yı seçin ve görüntülerin piksel boyutunu ayarlayın. Filopodia veya lamellipodia’daki bir F-actin demetinde en az beş zaman dilimi için geriye doğru akan bir aktivin benek bulun. Görüntü > Dönüştür > Döndür’ü seçin ve görüntülerin açısını F-actin demetinin yukarı doğru işaret etmesi için ayarlayın (Şekil 3A). Araç çubuğundaki Dikdörtgen’e tıklayın ve aktüer beneklerini ve F-actin paketinin ucunu içeren bir kutu çizin (Şekil 3B, 1 ve 2).NOT: HaloTag-actin beneklerinin sinyalleri zayıftır. Ek olarak, büyüme konisinin distal uçlarındaki Lifeact sinyalleri zayıf ve soluktur (Şekil 2B), çünkü büyüme konisinin distal uçları proksimal kısma göre incedir. Araştırmacılar, F-aksin akış hızı ve polimerizasyon oranının nicelliklerini optimize etmek için sinyalleri geliştirmelidir (Şekil 3B). Proksimal büyüme konislerindeki Lifeact sinyali doygun hale gelse de, bu F-actinlerin distal ucunun belirlenmesini bozmaz (Şekil 3E, sarı çizgi). Görüntü > Çoğalt’ı seçin ve beş zaman dilimini girin (Şekil 3B, 3-5). Montaj Yapmak > Resim > Yığınları’nı seçin ve parametreleri girin: Sütunlar, 5; Satırlar, 1; Ölçek faktörü, 1. Tamam’a tıklayın. Görüntü montajı ekranda görünecektir. Görüntü > Renk > Bölünmüş Kanallar’ı seçin. Bu, iki floresan kanalı ayırır. F-aktüen akış hızının ölçülmesi. Ölçümleri > Ayarla’yı ve Alan ve Sınırlayıcı Dikdörtgen’i seçin. Araç çubuğunda Oval’e tıklayın ve bir aksin lekesi üzerine bir daire çizin (Şekil 3C, 1 ve 2). Resim > Yer Paylaşımı’> Seçim Ekle’yi seçin. Daire görüntü montajı üzerine bindirilir (Şekil 3C, 3 ve 4).NOT: Kaplamanın rengi, > Seçenekleri > Renkleri Düzenle’de değiştirilebilir. Kalan benekler için dairelerin yer paylaşımını tekrarlayın (Şekil 3C, 5).NOT: Aktüen benek merkezlerini doğru bir şekilde belirlemek için, araştırmacılar benekler üzerindeki daireleri kaplamalıdır. Araç çubuğunda Düz’e tıklayın ve dairelerin merkezlerini birbirine bağlayan bir çizgi çizin (Şekil 3D, 1 ve 2). Ölçü > Çözümle’yi seçin. Sonuç ekranda görünecektir (Şekil 3D, 3).NOT: Sonuçta görüntülenen yükseklik , gözlem sırasında akin benekinin translokasyon mesafesini gösterir (Şekil 3D, 3). Translokasyon mesafesini gözlem süresine bölerek F-aktikli akış hızını hesaplayın. F-aktüer polimerizasyon oranının nicelemesi. F-actin paketinin uçlarını birbirine bağlayan bir çizgi çizin (Şekil 3E, 1). Ölçü > Çözümle’yi seçin. Sonuç ekranda görünecektir (Şekil 3E, 2).NOT: Sonuçtaki yükseklik , gözlem sırasında F-actin demetinin uzatma uzunluğunu gösterir (Şekil 3E, 2). Uzatma uzunluğunu gözlem süresine bölerek F-actin uzatma oranını hesaplayın. F-actin polimerizasyon oranını F-actin akış hızı ve uzatma hızının toplamı olarak hesaplayın (Şekil 3F). 7. Çekiş kuvveti mikroskopisi ve nöron kültürleri için paa jelinin hazırlanması Çekiş kuvveti mikroskopisi için gerekli PAA jellerinin hazırlanması (Şekil 4) Pipet 0,5 mL NaOH (100 mM), damıtılmış H2O’da, 27 mm çapında cam tabanlı tabaklarda çözülür ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yaslanabilir. Bulaşıklardaki NaOH çözeltisine 50 μL 3-aminopropyltrimethyoxysilane (APTMS) ekleyin ve çözeltileri hafif pipetleme ile karıştırın ve RT’de 15 dakika kuluçkaya yatırın. Cam tabanlı bulaşıkları damıtılmış H2O ile yıkayın ve kurutun. Pipet 0.5 mL% 0.5 glutaraldehit çözeltisi, PBS’de çözünmüş, APTMS ile işlenmiş cam tabanlı tabakta ve RT’de 30 dakika kuluçkaya yatır. Cam tabanlı bulaşıkları damıtılmış H2O ile yıkayın ve kurutun. Damıtılmış H2O (412 μL), (w/v) akrilamid çözeltisi (63 μL), %2,5 (w/v) bis-akrilamid çözeltisi (6 μL) ve karboksilat modifiye mikroküreç (floresan boncuk) çözeltisi (20 μL) içeren bir çözelti hazırlayın.NOT: Akrilamid çözeltisine eklemeden önce agrega boncuklarını ayrıştırmak için floresan boncuk çözeltisini girdap. RT’de 30 dakika boyunca çözümü bir vakum odasında gazdan arındırın. Bu çözüme, damıtılmış H2O’da çözünmüş% 10 (w/ v) amonyum persülfat (APS) ve 1 μL N,N,N’, N’-tetrametilenilenediamin (TEMED) ekleyin ve hafif pipetleme ile karıştırın. 15 mL santrifüj tüpünün kapağına bir cam kapak kılıfı (18 mm çapında) yerleştirin. Hemen kapak kapağına 25 μL çözelti ekleyin ve ardından kapak kapağına ters cam tabanlı bir kabı hafifçe yerleştirin. Akrilamidin RT’de 1 saat polimerize olmasını izin verin. Damıtılmış H2O’yu kapak ucuna uygulayın ve bükülmüş bir uçlu bir şırınga iğnesi kullanarak jelden soyun. H2O’yu çıkarın ve PBS’de çözünmüş sülfo-SANPAH’ı (1 mM) jelin içine ekleyin. Steril koşullar altında, jelleri 5 dakika boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın. Jeli PBS ile yıkama başına 15 dakika boyunca üç kez yıkayın. Mikrokürez girinti yöntemi ile jel sertliğinin belirlenmesi (Şekil 5A)44. Çapı ve yoğunluğu için belirtilen bir mikrosferi jelin içine aktarın ve ardından lazer tarama konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin. Jel yüzeye odaklanın ve z pozisyonunu kaydedin (Şekil 5B). Benzer şekilde, mikro kürenin altına odaklanın ve z pozisyonunu kaydedin (Şekil 5C). Jel yüzeyinin z-konumları ile mikrosferin tabanı arasındaki farka göre belirlenen girinti derinliğini hesaplayın. Young’ın jelin E modüllerini şu şekilde hesaplayın:burada f mikro kürenin yüzdürülmüş ağırlığıdır, d jelin girinti derinliğidir, r mikro kürenin yarıçapıdır ve v Poisson’un oranıdır (değeri daha önce belirlendiği gibi 0,3’tür46). Jelleri bölüm 2’de açıklandığı gibi PDL ve laminin ile kapla. Bölüm 3 ve 4’te açıklandığı gibi, E16 fare embriyolarını parçalara ayırın, hipokampiyi ayırın ve 1.0 x 106 hücre başına 5 μg pEGFP-C1 ile transfect. PDL/laminin kaplı jeller üzerinde tohum 2.0 x 105 hücre.NOT: Çekiş kuvveti analizi için, büyüme koni alanının belirlenmesi için floresan etiketli hücrelerin mikroskobik görüntülenmesi gereklidir. 8. Nöronal büyüme konilerinde çekiş kuvveti mikroskopisi DIV3’te kültür ortamını % 2 B-27 takviyesi, glutamin (1 mM), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) içeren 0,5 mL ısıtılmış Leibovitz’in L-15 ortamıyla değiştirin. Nöronları 37 °C’de 1 saat koruyun. Lazer tarama konfokal mikroskobu açın ve sahne üstü inkübatörü 37 °C olarak ayarlayın.NOT: Bu çalışmada 63x/1.2 NA su daldırma objektif lensi ve görüntü alma ve analiz yazılımı ile donatılmış lazer taramalı konfokal mikroskop sunulmuştur (bkz. Nöronları önceden ısıtılmış sahne üstü inkübatörün üzerine cam tabanlı tabağa yerleştirin. Görüntü alma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: tarama boyutu, 512 × 512 piksel; tarama alanı, 1,5-3x yakınlaştırma; tarama hızı, kare başına ~1 s; lazer dalga boyu, 561 nm (floresan boncuklar için ekscitasyon dalga boyu) ve 488 nm (gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) için heyecan dalga boyu); zaman aralığı, 3 s; süre, 50 kare. Büyüme konisi morfolojisini görselleştirmek için EGFP’yi güçlü bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçin. Jel yüzeye odaklanın ve hızlandırılmış görüntüler elde edin (Şekil 6A ve Ek Dosya 4).NOT: Çekiş analizi için iki floresan kanal (floresan boncuklar ve EGFP için) ve parlak alan kanalı (diferansiyel girişim kontrastı (DIC) veya faz kontrastı görüntüleri yakalamanız önerilir) kullanın. Tek kanallı zaman atlamalı RGB görüntü yığınları oluşturmak ve bu görüntüleri tiff dosyaları olarak kaydetmek için bir görüntü işleme yazılımı (örneğin, Fiji) kullanın.NOT: Araştırmacıların ham verileri de kaydetmesi önemlidir. Alt tabakadan nöronları serbest bırakarak jel substratını gevşetmek için cam tabanlı yemeğe, damıtılmış H2O’da çözünmüş% 10 (w/v) sodyum dodecyl sülfat (SDS) 100 μL uygulayın. Sıcaklığı stabilize etmek için kabı 37°C’de 5 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Boncukların sınırlanmamış bir substrattaki görüntüsü, çekiş kuvveti analizi sırasında orijinal boncuk konumlarına başvurmak için kullanılır (Şekil 6C). SDS çözeltisinin uygulanması, inkübatördeki termal değişim ve hücre kaynaklı deformasyonun gevşemesi nedeniyle ksist konumlarını değiştirir. Bu nedenle, araştırmacıların odak düzlemini ve x-y pozisyonunu düzeltmeleri gerekir. Jel yüzeyine odaklanın ve sınırlanmamış substrattaki boncukların bir görüntüsünü elde edin (Şekil 6B). Sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncukların tek kanallı RGB görüntüsünü üretin ve bu görüntüyü bir tiff dosyası olarak kaydedin. Fiji kullanılarak sınırlandırılmamış substrattaki boncuk görüntüsünün x-y konumunun düzeltilmesi Fiji’de, kısıtlanmamış alt tabakadaki boncuk görüntüsünü ve floresan boncukların zaman atlamalı yığın görüntüsünü açın. Birleştirme > Resim > Yığınları > Araçları’nı seçin. Ekranda bir diyalog kutusu görünecektir (Şekil 7A, 1). Sırasıyla, sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncuk görüntüsünü ve Image1 ve Image2’deki floresan boncukların zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçin (Şekil 7A, 2). Tamam’a tıklayın. Sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncuk görüntüsü zaman atlamalı yığın görüntüsüne eklenir (Şekil 7A, 3). Kaydırma çubuğunu (Şekil 7B, 1, kırmızı çerçeve) kullanarak yığın görüntüsünün ikinci karesini (kırmızı ok) görüntüleyin. StackReg> Eklentiler’i seçin (Şekil 7B, 2). Ekranda bir diyalog kutusu görünecektir (Şekil 7B, 3). Açılan listeden Sert Gövde’yi seçin (Şekil 7B, 3, kırmızı çerçeve) ve Tamam’a tıklayın. X-y konumunun düzeltilmesi daha sonra başlar. x-y konum düzeltilmiş yığın görüntüsünün ilk karesini görüntülemek için kaydırma çubuğunu kullanın. Resim > Çoğalt’ı seçin (Şekil 7C, 1). Ekranda bir diyalog kutusu görünecektir (Şekil 7B, 2). Aralık’a 1 girin, Yinelenen Yığın’ın seçimini kaldırın (Şekil 7C, 2) ve Tamam’ı tıklatın. Kısıtlanılmamış alt tabakadaki x-y konum düzeltilmiş boncuk görüntüsü ekranda görünecektir (Şekil 7C, 3). Bu görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin. Çekiş kuvvetinin nicelleştirilmesiNOT: Çekiş kuvveti analizi için burada açıklanan yöntem MATLAB ve iki MATLAB araç kutusu kullanır, ‘Görüntü İşleme Araç Kutusu’ ve ‘Paralel Bilgi İşlem Araç Kutusu’. Müfettişlerin analizden önce bunları kurmaları gerekecektir. Çekiş kuvveti analiz kodu MATLAB sürüm 2018a’ya dayanarak geliştirilmiştir. Bu nedenle, analiz için MATLAB sürüm 2018a (veya daha yenisi) kullanılmalıdır. Çekiş kuvveti analizi için kullanılan algoritmalar daha önce tanımlanmıştır22. Ek Dosya 5’ten çekiş kuvveti analiz kodu TFM2021’i indirin. MATLAB’da TFM 2021’i açın TFM2021’de ana .m açın ve çalıştırın. Ekranda bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) görünecektir (Şekil 8A). Sınırlanmamış substrat görüntüsünü yükle’ye tıklayın ve sınırlandırılmamış alt tabakada x-y konum düzeltilmiş boncuk görüntüsünü seçin. Floresan boncuk görüntülerini yükle’ye tıklayın ve boncukların zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçin. Parlak alan görüntülerini yükle’ye tıklayın ve parlak alanın zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçin. GFP Görüntülerini Yükle’ye tıklayın ve EGFP’nin zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçin. GUI’deki açılan listeden GFP’yi seçin (Şekil 8A, kırmızı kutu). GUI’de görüntülenen hücre görüntüsünde iki noktayı tıklatarak büyüme konisi de dahil olmak üzere ilgi çekici dikdörtgen bölgeyi (ROI) belirtmek için yatırım getirisine tıklayın (Şekil 8B). GUI’deki Kaydet düğmesine tıklayın (Şekil 8A, kırmızı ok). Seçilen yığın görüntüleri, yatırım getirisi ile birlikte bir .mat dosyasına (MATLAB biçimli dosya) kaydedilir. Spot algıla’ya tıklayın. Ekranda bir diyalog kutusu görünecektir. Boncuk algılama eşiğini belirlemek için diyalog kutusuna bir değer (genellikle 50-150) girin. Tamam’ı tıklatma hesaplamayı başlatır. Hesaplamayı bitirdikten sonra, 8.12.8 adımında seçilen bölgeyi büyütmek ve algılanan boncukları beyaz noktalar olarak görüntülemek için Parçayı Çiz’e tıklayın (Şekil 8C, 1).NOT: Boncuk algılamanın (beyaz noktalar) floresan boncuklarla çakışıp örtüşmediğini onaylayın. Boncuk algılama arka plan gürültüsünü de algılayabilir. Bu dış paraziti azaltmak için Spot algılamada eşik değerini değiştirin. Ayrıca, 8.12.13. Boncuk seç’e tıklayın ve büyüme konisinin altındaki doğru noktaları içeren çokgen bir bölgeyi sınırlayın. Klavyede Enter tuşuna basın. Çokgen bölgedeki beyaz noktalar kırmızı renge dönüşür (Şekil 8C, 2). GUI’de Tahmin kuvveti’ne tıklayın. Ardından, aşağıdaki parametreler için giriş değerleri: piksel boyutu, μm / piksel; Young’ın modülü, Adım 7.2.5’te hesaplanan değer; Poisson’ın oranı 0.3. Hesaplamayı başlatmak için Tahmin kuvvetini yürütün. Yazılım, hesaplama sonuçlarını otomatik olarak bir elektronik tablo biçimli dosyaya kaydeder.NOT: Elektronik tablo her zaman diliminde x bileşenini, y bileşenini ve kuvvet büyüklüğünü gösterir (Şekil 8D). Çekiş kuvveti ölçmek için uygulama verileri için Ek Dosya 6’ya bakın.