Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

Tutti gli esperimenti che utilizzano animali da laboratorio sono stati eseguiti con il Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali del Nara Institute of Science and Technology. Gli sperimentatori dovrebbero seguire le linee guida stabilite dai loro comitati istituzionali e nazionali di regolamentazione degli animali per la cura e l’uso degli animali da laboratorio. 1. Preparazione di soluzioni e media Preparare le soluzioni e i supporti di coltura come riepilogato nel file supplementare 1 2. Preparazione di substrati rivestiti di poli-D-lisina (PDL)/laminina Rivestire piatti con fondo di vetro da 14 mm di diametro con 100 μg/mL PDL, disciolti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4), e incubare per la notte in un incubatore umidificato a 37 °C.NOTA: non asciugare le superfici vetrate dopo questo passaggio Rimuovere la soluzione PDL e la pipetta 1 mL di PBS sul vetro per 10 s tre volte. Rivestire le piastre con laminina da 5 μg/mL, sciolta in PBS, e incubare per la notte in un incubatore umidificato a 37 °C. Rimuovere la soluzione di laminina e la pipetta 1 mL di PBS sul vetro per 10 s tre volte. Rimuovere il PBS e posizionare 0,5 ml del mezzo neurobasale sulle superfici vetrate. Conservare i piatti in un incubatore umidificato a 37 °C.NOTA: i piatti rivestiti di PDL/laminina possono essere conservati per 2-3 giorni in un incubatore umidificato a 37 °C. 3. Dissezione e dissociazione dell’ippocampo Eutanasia di un topo in gravidanza per lussazione cervicale.NOTA: Il presente studio utilizza topi disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). I ricercatori dovrebbero usare topi allevati e trattati umanamente in un ambiente sterilizzato. Seziona gli embrioni embrionali di topo del giorno 16 (E16) e mettili sul ghiaccio. In una cappa a flusso laminare, sezionare il cervello con le forbici e metterli su un piatto sterile di 10 cm contenente 10 ml di soluzione di dissezione ghiacciata. Con uno stereomicroscopio a dissezione, staccare con cura le meningi degli emisferi cerebrali e quindi sezionare l’ippocampo usando una pinza. Trasferire l’ippocampo in 5 mL di soluzione di digestione ghiacciata in un tubo da 15 ml. Incubare l’ippocampo a bagnomaria per 20 minuti a 37 °C. Rimuovere la soluzione di digestione e aggiungere 3 ml di soluzione di dissezione. Pipettare delicatamente l’ippocampo quattro volte con una pipetta Pasteur. Incubare l’ippocampo a bagnomaria per 20 minuti a 37 °C. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 50 ml. Aggiungere 3 ml di nuova soluzione di dissezione al tessuto non dissociato. Ripeti i passaggi 3.7-3.9 fino a quando l’ippocampo non è completamente dissociato. Rimuovere gli aggregati galleggianti di DNA dalla sospensione cellulare ruotando e aspirando con una pipetta Pasteur. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 20 min a 4 °C.NOTA: il DNA derivato da cellule danneggiate disturberà il processo di centrifugazione. Se i neuroni rimangono nel surnatante, centrifugare nuovamente la sospensione cellulare dopo aver accuratamente rimosso il DNA. Equilibrare il mezzo neurobasale contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL) in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. 4. Trasfezione e coltura dei neuroni Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di PBS ghiacciato nel tubo da 50 ml. Risospesso il pellet cellulare mediante un delicato pipettaggio. Trasferire 10 μL della sospensione cellulare in un tubo microcentrifuga, aggiungere 10 μL di soluzione blu di tripano allo 0,5% e quindi contare il numero di cellule con un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare nel tubo da 50 mL a 180 x g per 20 min a 4 °C. Nel frattempo, aliquota per la trasfezione, 1 μg di pFN21A-HaloTag-actina e 3 μg di pmNeonGreen-N1-Lifeact per 1 x 106 cellule, in un tubo microcentrifuga. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e aggiungere 100 μL di mezzo di elettroporazione (fornito dal kit di trasfezione) nel tubo da 50 ml. Risospesso il pellet cellulare mediante pipettaggio. Mescolare la sospensione cellulare con la soluzione di DNA aliquotato e trasferire la miscela in una cuvetta (fornita dal kit di trasfezione).NOTA: poiché le bolle d’aria disturbano l’elettroporazione, rimuoverle dalla sospensione cellulare. Inserire la cuvetta nell’apparato di elettroporazione (Tabella dei materiali) ed eseguire l’elettroporazione utilizzando il programma O-005. Aggiungere immediatamente 1 mL del mezzo neurobasale preriscaldato ed equilibrato contenente il 10% di FBS, penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 μg/mL) alla cuvetta. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 ml utilizzando una pipetta di plastica (fornita dal kit di trasfezione). Trasferire 10 μL della sospensione cellulare in un microtubo, aggiungere 10 μL di soluzione blu di tripano allo 0,5% e quindi contare il numero di cellule con un emocitometro. Estrarre i piatti con fondo di vetro rivestiti di PDL / laminina dall’incubatrice e rimuovere il mezzo neurobasale. Pipettare 0,5 mL della sospensione cellulare contenente 2,0 x 105 celle per piatto e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO2 per 3 ore. Sostituire il mezzo con 0,5 mL di mezzo neurobasale contenente il 2% di integratore B-27, glutammina (1 mM), penicillina (100 U / mL) e streptomicina (100 μg / mL). Coltivare i neuroni in un incubatore umidificato per 3 giorni a 37 °C con il 5% di CO2. 5. Imaging a singola macchia ai coni di crescita neuronale Il giorno in vitro (DIV) 3, trattare i neuroni con ligando tetrametil-rodamina (TMR) ad una diluizione di 1:2000 diluizione in terreno di coltura. Mantenere i neuroni per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2. Lavare il ligando TMR tre volte con PBS preriscaldato. Rimuovere il PBS e la pipetta 0,5 mL di mezzo L-15 di Leibovitz riscaldato contenente il supplemento B-27 al 2%, glutammina (1 mM), penicillina (100 U / mL) e streptomicina (100 μg / mL). Mantenere i neuroni per 1 ora a 37 °C. Accendere un microscopio a epifluorescenza e impostare l’incubatore da palcoscenico a 37 °C.NOTA: Il presente protocollo utilizza un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera a semiconduttore complementare di ossido di metallo, una lente obiettivo ad immersione in olio 100x/1,40 NA, una lampada al mercurio e un software di acquisizione di immagini (vedi Tabella dei materiali). Per questa analisi possono essere utilizzati anche altri microscopi a epifluorescenza con specifiche equivalenti. Posizionare i neuroni trattati con ligando TMR nel piatto con fondo di vetro sull’incubatrice riscaldata superiore dello stadio. Impostare i parametri di acquisizione dell’immagine come segue: tempo di esposizione, 500 ms per i canali fluorescenti Lifeact e HaloTag-actina; binning, 1 x 1 (0,065 μm × 0,065 μm per pixel); intervallo di tempo, 3 s; durata, 50 fotogrammi. Selezionare un cono di crescita che esprima fortemente Lifeact ed esprima debolmente HaloTag-actina.NOTA: l’espressione di Lifeact deve essere abbastanza forte da visualizzare la morfologia del cono di crescita. L’espressione di HaloTag-actina deve essere debole e insufficiente per essere rilevata (Figura 2A). I livelli di espressioni proteiche fluorescenti possono essere regolati variando la quantità di DNA per la trasfezione. Chiudere il campo del diaframma per illuminare un’area minima che include il cono di crescita (Figura 2B).NOTA: L’illuminazione di un’area minima riduce il segnale di fondo e aumenta il rapporto segnale di fluorescenza / rumore (S/ N), consentendo il rilevamento di macchie di actina (Figura 2B). Per aumentare ulteriormente il rapporto S/N, si consiglia di illuminare il cono di crescita senza ridurre la luce con filtri a densità neutra. Acquisire immagini time-lapse (File supplementare 2). Salva come immagine stack time-lapse multicanale (formato tiff). 6. Quantificazioni della velocità del flusso di F-actina e della velocità di polimerizzazione utilizzando un software di elaborazione e analisi delle immagini Fiji NOTA: fare riferimento al file supplementare 3 per i dati di pratica per quantificare la velocità del flusso di F-actina e il tasso di polimerizzazione dell’actina. Apri l’immagine dello stack time-lapse multicanale su Fiji. Selezionare Analizza > Imposta scala e impostare la dimensione in pixel delle immagini. Trova una macchia di actina che scorre retrogradamente per un minimo di cinque intervalli di tempo all’interno di un fascio di F-actina in filopodia o lamellipodia. Selezionare Immagine > Trasforma > Ruota e regolare l’angolo delle immagini in modo che il fascio di F-actina punti verso l’alto (Figura 3A). Fare clic su Rettangolo sulla barra degli strumenti e disegnare una casella che include macchie di actina e la punta del fascio F-actina (Figura 3B, 1 e 2).NOTA: I segnali delle macchie di HaloTag-actina sono deboli. Inoltre, i segnali Lifeact sulle punte distali del cono di crescita sono deboli e deboli (Figura 2B) perché le punte distali del cono di crescita sono sottili rispetto alla parte prossimale. I ricercatori dovrebbero migliorare i segnali per ottimizzare le quantificazioni della velocità del flusso di F-actina e della velocità di polimerizzazione (Figura 3B). Sebbene il segnale Lifeact al cono di crescita prossimale diventi saturo, ciò non disturberà la determinazione dell’estremità distale delle F-actine (Figura 3E, linea gialla). Selezionare Immagine > Duplica e immettere i cinque intervalli di tempo (Figura 3B, 3-5). Selezionare Image > Stacks > Make Montage e immettere i parametri: Colonne, 5; File, 1; Fattore di scala, 1. Fare clic su OK. Il montaggio dell’immagine apparirà sullo schermo. Selezionare Immagine > Colore > Canali divisi. Questo separa i due canali fluorescenti. Quantificazione della velocità del flusso di F-actina. Selezionate Analizza > Imposta misure (Set Measurements) e Scegliete Area (Area ) e Rettangolo di delimitazione (Bounding Rectangle). Fare clic su Oval sulla barra degli strumenti e disegnare un cerchio su una macchia di actina (Figura 3C, 1 e 2). Selezionare Immagine > Sovrapposizione > Aggiungi selezione. Il cerchio è sovrapposto al montaggio dell’immagine (Figura 3C, 3 e 4).NOTA: il colore della sovrapposizione può essere modificato in Modifica opzioni > > colori. Ripetere la sovrapposizione dei cerchi per le macchie rimanenti (Figura 3C, 5).NOTA: per determinare con precisione i centri di macchie di actina, gli investigatori dovrebbero sovrapporre cerchi sulle macchie. Fare clic su Dritto sulla barra degli strumenti e disegnare una linea che collega i centri dei cerchi (Figura 3D, 1 e 2). Selezionare Analizza > misura. Il risultato apparirà sullo schermo (Figura 3D, 3).NOTA: l’altezza visualizzata nel risultato indica la distanza di traslocazione della macchia di actina durante l’osservazione (Figura 3D, 3). Calcola la velocità del flusso di F-actina dividendo la distanza di traslocazione per il tempo di osservazione. Quantificazione del tasso di polimerizzazione della F-actina. Disegnare una linea che colleghi le punte del fascio di F-actina (Figura 3E, 1). Selezionare Analizza > misura. Il risultato apparirà sullo schermo (Figura 3E, 2).NOTA: l’altezza nel risultato indica la lunghezza di estensione del fascio di F-actina durante l’osservazione (Figura 3E, 2). Calcola il tasso di estensione della F-actina dividendo la lunghezza dell’estensione per il tempo di osservazione. Calcolare il tasso di polimerizzazione della F-actina come somma della velocità del flusso di F-actina e della velocità di estensione (Figura 3F). 7. Preparazione di un gel PAA per microscopia a forza di trazione e colture neuronali Preparazione dei gel PAA necessari per la microscopia con forza di trazione (Figura 4) Pipetta 0,5 mL di NaOH (100 mM), disciolta in H2O distillato, su piatti con fondo di vetro da 27 mm di diametro, e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Aggiungere 50 μL di 3-aminopropiltrimetossisilano (APTMS) nella soluzione di NaOH sui piatti e mescolare le soluzioni mediante pipettaggio delicato e incubare per 15 minuti a RT. Lavare i piatti con fondo di vetro con H2O distillato e asciugare. Pipettare 0,5 mL di soluzione di glutaraldeide allo 0,5%, disciolta in PBS, sul piatto di fondo di vetro trattato con APTMS, e incubare per 30 minuti a RT. Lavare i piatti con fondo di vetro con H2O distillato e asciugare. Preparare una soluzione contenente soluzione distillata di H2O (412 μL), soluzione di acrilammide al 30% (p/v) (63 μL), soluzione di bis-acrilammide al 2,5% (p/v) (6 μL) e soluzione di microsfera modificata con carbossilato (perla fluorescente) (20 μL).NOTA: Vortice la soluzione di perline fluorescenti per dissociare le perle aggregate prima di aggiungerle alla soluzione di acrilammide. Degasare la soluzione in una camera a vuoto per 30 minuti a RT. A questa soluzione, aggiungere 1 μL di persolfato di ammonio al 10% (p/v) (APS), disciolto in H2O distillato, e 1 μL di N,N,N’,N’-tetrametiletilendiammina (TEMED), e mescolare mediante pipettaggio delicato. Posizionare un coperchio di vetro (diametro 18 mm) sul cappuccio di un tubo di centrifuga da 15 ml. Aggiungere immediatamente 25 μL della soluzione al coperchio, quindi posizionare delicatamente un piatto con fondo di vetro invertito sul coperchio. Lasciare polimerizzare l’acrilammide per 1 ora a RT. Applicare H2O distillato sul coperchio e staccarlo dal gel usando un ago per siringa con una punta piegata. Rimuovere l’H2O e aggiungere sulfo-SANPAH (1 mM), sciolto in PBS, al gel. In condizioni sterili, esporre i gel alla luce ultravioletta per 5 minuti. Lavare il gel tre volte con PBS per 15 minuti per lavaggio. Determinazione della rigidità del gel con un metodo di indentazione della microsfera (Figura 5A)44. Trasferire una microsfera specificata per il diametro e la densità al gel e quindi posizionarla sullo stadio campione di un microscopio confocale a scansione laser. Concentrarsi sulla superficie del gel e registrare la posizione z (Figura 5B). Allo stesso modo, concentrati sul fondo della microsfera e registra la posizione z (Figura 5C). Calcolare la profondità di rientro determinata dalla differenza tra le posizioni z della superficie del gel e il fondo della microsfera. Calcola il modulo E di Young del gel tramite:dove f è il peso corretto per galleggiamento della microsfera, d è la profondità di rientranza del gel, r è il raggio della microsfera e v è il rapporto di Poisson (il cui valore è 0,3, come determinato in precedenza46). Rivestire i gel con PDL e laminina come descritto nel paragrafo 2. Come descritto nei paragrafi 3 e 4, sezionare gli embrioni di topo E16, dissociare l’ippocampo e trasfettare con 5 μg di pEGFP-C1 per 1,0 x 106 cellule. Seme 2,0 x 105 cellule su gel rivestiti di PDL/laminina.NOTA: per l’analisi della forza di trazione, l’imaging microscopico di cellule marcate fluorescenti è necessario per determinare l’area del cono di crescita. 8. Microscopia della forza di trazione ai coni di crescita neuronale Su DIV3, sostituire il terreno di coltura con 0,5 mL di terreno L-15 di Leibovitz riscaldato contenente il 2% di integratore B-27, glutammina (1 mM), penicillina (100 U / mL) e streptomicina (100 μg / mL). Mantenere i neuroni per 1 ora a 37 °C. Accendere un microscopio confocale a scansione laser e impostare l’incubatore stage-top a 37 °C.NOTA: Il presente studio utilizza un microscopio confocale a scansione laser dotato di una lente ad immersione in acqua 63x/1,2 NA e di un software di acquisizione e analisi delle immagini (vedi Tabella dei materiali). Posiziona i neuroni nel piatto con fondo di vetro sull’incubatrice preriscaldata. Impostare i parametri di acquisizione dell’immagine come segue: dimensione della scansione, 512 × 512 pixel; area di scansione, zoom 1,5-3x; velocità di scansione, ~ 1 s per fotogramma; lunghezza d’onda laser, 561 nm (la lunghezza d’onda di eccitazione per le perle fluorescenti) e 488 nm (la lunghezza d’onda di eccitazione per la proteina fluorescente verde potenziata (EGFP)); intervallo di tempo, 3 s; durata, 50 fotogrammi. Per visualizzare la morfologia del cono di crescita, selezionare un cono di crescita che esprima fortemente EGFP. Concentrati sulla superficie del gel e acquisisci immagini time-lapse (Figura 6A e File supplementare 4).NOTA: per l’analisi della trazione, utilizzare due canali fluorescenti (per perline fluorescenti ed EGFP) e un canale a campo luminoso (si consiglia di acquisire immagini a contrasto di interferenza differenziale (DIC) o a contrasto di fase). Utilizzare un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, Fiji) per produrre stack di immagini RGB time-lapse a canale singolo e salvare queste immagini come file tiff.NOTA: è fondamentale che gli investigatori salvino anche i dati grezzi. Applicare 100 μL di 10% (p/v) di sodio dodecil solfato (SDS), disciolto in H2O distillato, sul piatto di fondo di vetro per rilassare il substrato di gel rilasciando neuroni dal substrato. Incubare il piatto per 5 minuti a 37°C per stabilizzare la temperatura.NOTA: l’immagine delle perline in un substrato non teso viene utilizzata per fare riferimento alle posizioni originali delle perline durante l’analisi della forza di trazione (Figura 6C). L’applicazione della soluzione SDS altera le posizioni xyz a causa del cambiamento termico nell’incubatore e del rilassamento della deformazione indotta dalla cellula. Gli investigatori, quindi, devono correggere il piano focale e la posizione x-y. Concentrati sulla superficie del gel e acquisisci un’immagine delle perline nel substrato non teso (Figura 6B). Produrre un’immagine RGB a canale singolo delle perline nel substrato non filtrato e salvare questa immagine come file tiff. Correzione della posizione x-y dell’immagine del tallone nel substrato non teso utilizzando Fiji Nelle Figi, apri l’immagine del tallone nel substrato non teso e l’immagine della pila time-lapse delle perline fluorescenti. Selezionate Immagine > Pile > Strumenti (> Concatena). Sullo schermo verrà visualizzata una finestra di dialogo (Figura 7A, 1). Selezionare l’immagine del tallone nel substrato non teso e l’immagine dello stack time-lapse delle perline fluorescenti rispettivamente in Image1 e Image2 (Figura 7A, 2). Fare clic su OK. L’immagine del tallone nel substrato non teso viene aggiunta all’immagine dello stack time-lapse (Figura 7A, 3). Utilizzando la barra di scorrimento (Figura 7B, 1, cornice rossa), visualizzare il secondo fotogramma dell’immagine dello stack (freccia rossa). Selezionare Plugin > StackReg (Figura 7B, 2). Sullo schermo apparirà una finestra di dialogo (Figura 7B, 3). Selezionate Corpo rigido (Rigid Body ) dall’elenco a discesa (Figura 7B, 3, cornice rossa) e fate clic su OK. Inizia quindi la correzione della posizione x-y. Utilizzate la barra di scorrimento per visualizzare il primo fotogramma dell’immagine dello stack con correzione posizione x-y. Selezionare Immagine > Duplica (Figura 7C, 1). Sullo schermo apparirà una finestra di dialogo (Figura 7B, 2). Immettere 1 nell’intervallo, deselezionare Stack duplicato (Figura 7C, 2) e fare clic su OK. L’immagine del tallone corretto per la posizione x-y nel substrato non teso apparirà sullo schermo (Figura 7C, 3). Salva questa immagine come file tiff. Quantificazione della forza di trazioneNOTA: Il metodo qui descritto per l’analisi della forza di trazione utilizza MATLAB e due toolbox MATLAB, ‘Image Processing Toolbox’ e ‘Parallel Computing Toolbox’. Gli investigatori dovranno installarli prima dell’analisi. Il codice di analisi della forza di trazione è stato sviluppato sulla base della versione MATLAB 2018a. Pertanto, MATLAB versione 2018a (o successiva) deve essere utilizzato per l’analisi. Gli algoritmi utilizzati per l’analisi della forza di trazione sono stati descritti in precedenza22. Scarica il codice di analisi della forza di trazione TFM2021 dal file supplementare 5. Apri TFM 2021 in MATLAB Apri main.m in TFM2021 ed eseguilo. Sullo schermo verrà visualizzata un’interfaccia utente grafica (GUI) (Figura 8A). Fare clic su Carica immagine del substrato non teso e selezionare l’immagine del tallone corretto per la posizione x-y nel substrato non teso. Fare clic su Carica immagini di perline fluorescenti e selezionare l’immagine dello stack time-lapse delle perline. Fare clic su Carica immagini a campo luminoso e selezionare l’immagine dello stack time-lapse di bright-field. Fare clic su Carica immagini GFP e selezionare l’immagine dello stack time-lapse di EGFP. Selezionare GFP dall’elenco a discesa nella GUI (Figura 8A, casella rossa). Fare clic su ROI per specificare la regione di interesse del rettangolo (ROI), incluso il cono di crescita, facendo clic su due punti sull’immagine della cella visualizzata nella GUI (Figura 8B). Fare clic sul pulsante Salva sulla GUI (Figura 8A, freccia rossa). Le immagini dello stack selezionate, insieme al ROI, verranno salvate in un file .mat (file in formato MATLAB). Fare clic su Rilevamento spot. Sullo schermo apparirà una finestra di dialogo. Immettere un valore (in genere 50-150) nella finestra di dialogo per determinare una soglia per il rilevamento di perline. Facendo clic su OK viene avviato il calcolo. Dopo aver terminato il calcolo, fare clic su Traccia traccia per ingrandire la regione selezionata al passaggio 8.12.8 e visualizzare le perline rilevate come punti bianchi (Figura 8C, 1).NOTA: verificare se il rilevamento delle perline (punti bianchi) si sovrappone alle perline fluorescenti. Il rilevamento di perline può anche rilevare il rumore di fondo. Per ridurre questa interferenza esterna, modificare il valore di soglia in Rilevamento spot. Inoltre, selezionare manualmente i punti corretti al passaggio 8.12.13. Fare clic su Seleziona perline e delimitare una regione poligonale che includa i punti corretti sotto il cono di crescita. Premere Invio sulla tastiera. I punti bianchi all’interno della regione poligonale cambieranno in un colore rosso (Figura 8C, 2). Fare clic su Stima forza sulla GUI. Quindi, i valori di input per i seguenti parametri: dimensione dei pixel, μm / pixel; modulo di Young, il valore calcolato al passo 7.2.5; Rapporto di Poisson, 0,3. Eseguire la forza stima per avviare il calcolo. Il software salverà automaticamente i risultati del calcolo in un file in formato foglio di calcolo.NOTA: il foglio di calcolo mostra la componente x, la componente y e la magnitudine della forza in ogni intervallo di tempo (Figura 8D). Fare riferimento al file supplementare 6 per i dati di pratica per quantificare la forza di trazione.