İn Vitro β-galaktosidaz İfade Eden Parazitleri Kullanarak Trypanosoma cruzi'nin Tüm Yaşam Döngüsü Aşamalarına Karşı İlaç Taraması
Summary
Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi’nin üç yaşam döngüsü aşamasında β-galaktosidaz aktivitesini ölçen yüksek verimli bir kolorimetrik tahlil tanımladık. Bu tahlil, tripanosidal bileşikleri kolay, hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde tanımlamak için kullanılabilir.
Abstract
Trypanosoma cruzi , Latin Amerika’da halk sağlığı açısından önem taşıyan endemik bir hastalık olan Chagas hastalığının (ChD) etken maddesidir ve göçün artması nedeniyle endemik olmayan birçok ülkeyi de etkilemektedir. Bu hastalık yaklaşık 8 milyon insanı etkilemektedir ve yeni vakaların yılda 50.000 olduğu tahmin edilmektedir. 1960’larda ve 70’lerde, ChD tedavisi için iki ilaç tanıtıldı: nifurtimox ve benznidazol (BZN). Her ikisi de yenidoğanlarda ve hastalığın akut fazında etkilidir, ancak kronik fazda değildir ve kullanımları önemli yan etkilerle ilişkilidir. Bu gerçekler, T. cruzi’ye karşı yeni ilaç arayışını yoğunlaştırmanın acil ihtiyacının altını çizmektedir.
T. cruzi , Reduviidae ve Hemiptera familyalarının hematofajöz böcek vektörleri yoluyla bulaşır. Memeli konağına girdikten sonra, kamçılanmamış amastigot formu olarak hücre içi olarak çoğalır ve kan dolaşımı replikatif olmayan enfektif form olan tripomastigote farklılaşır. Böcek vektörünün içinde, tripomastigotlar epimastigot aşamasına dönüşür ve ikili fisyon yoluyla çoğalır.
Bu yazıda, substrat, klorofenol kırmızısı β-D-galaktopiranosid (CPRG) kullanılarak parazit lizisi nedeniyle kültüre salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin ölçülmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Bunun için, T. cruzi Dm28c suşu β-galaktosidaz aşırı eksprese eden plazmid ile transfekte edildi ve epimastigote, tripomastigote ve amastigot aşamalarında in vitro farmakolojik tarama için kullanıldı. Bu yazıda ayrıca, kültürlenmiş epimastigotlarda, amastigotlarla enfekte Vero hücrelerinde ve referans ilaç benznidazol kullanılarak kültürlenmiş hücrelerden salınan tripomastigotlarda enzimatik aktivitenin nasıl ölçüleceği açıklanmaktadır. Bu kolorimetrik analiz kolayca gerçekleştirilir ve yüksek verimli bir formata ölçeklendirilebilir ve diğer T. cruzi suşlarına uygulanabilir.
Introduction
Chagas hastalığı (ChD) veya Amerikan tripanosomiasis, kamçılı protozoan Trypanosoma cruzi’nin (T. cruzi) neden olduğu paraziter bir hastalıktır. ChD, genellikle teşhis edilmeyen asemptomatik veya oligosemptomatik akut faz ile başlar, bunu yaşam boyu süren kronik bir faz izler. Kroniklikte, hastaların ~% 30’u enfeksiyondan on yıllar sonra ortaya çıkar – miyokardiopati, mega-sindirim sendromları veya her ikisi de dahil olmak üzere çeşitli zayıflatıcı koşullar,% 0.2 ila% 20 arasında değişen bir ölüm oranı1,2,3. Asemptomatik kronik hastaların klinik bulguları olmayabilir, ancak yaşamları boyunca seropozitif kalırlar.
Tahminler, dünya çapında ~ 7 milyon insanın, çoğunlukla ChD’nin endemik olduğu Latin Amerika’dan enfekte olduğunu göstermektedir. Bu ülkelerde, T. cruzi esas olarak enfekte kan emici triatomin böcekleri (vektör kaynaklı bulaşma) yoluyla ve daha az sıklıkla parazitleri içeren triatomin dışkısı ile kontamine olmuş gıdaların yutulması yoluyla oral yolla bulaşır. Ek olarak, parazit plasenta yoluyla chagasic annelerden yenidoğanlara, kan nakli yoluyla veya organ nakli sırasında bulaşabilir. Enfeksiyonu ve insan göçünü elde etmenin bu vektörden bağımsız yolları, Kuzey Amerika, Avrupa ve bazı Afrika, Doğu Akdeniz ve Batı Pasifik ülkelerinde artan sayıda vaka ile kanıtlanan hastalığın dünya çapında yayılmasına katkıda bulunmuştur4. ChD, vektör kaynaklı bulaşma yoksullukla yakından ilişkili olduğu ve özellikle Latin Amerika düşük gelirli ülkelerinde önde gelen bir halk sağlığı sorunu olduğu için ihmal edilmiş bir hastalık olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler olmasına rağmen, Latin Amerika’da ChD’ye bağlı mortalite, sıtma2 de dahil olmak üzere paraziter hastalıklar arasında en yüksektir.
1960’ların sonlarında ve 1970’lerin başında ChD tedavisi için iki kayıtlı ilaç vardır: nifurtimox ve benznidazol5. Her iki ilaç da yetişkinlerde, çocuklarda ve doğuştan enfekte olmuş yenidoğanlarda ve ayrıca kronik enfeksiyonu olan çocuklarda hastalığın akut fazında etkilidir. Bununla birlikte, sadece birkaç kişiye zamanında tedavi edilecek kadar erken teşhis konur. Son klinik çalışmalara göre, her iki ilacın da yetişkinlerde önemli sınırlamaları vardır ve kronik hastalığı olan kişilerde semptomları azaltmada etkisizdir; Bu nedenle, bu aşamada kullanımları tartışmalıdır. Diğer dezavantajlar, gerekli olan uzun tedavi süreleri (60-90 gün) ve gözlenen sık, ciddi yan etkilerdir ve bu da enfekte kişilerin bir oranında tedavinin kesilmesine yol açmaktadır 6,7. ChD’li kişilerin% 10’undan daha azının teşhis edildiği ve hatta daha azının tedaviye erişimi olduğu tahmin edilmektedir, çünkü etkilenen birçok birey sağlık hizmetlerine erişimi olmayan veya az olan kırsal alanlarda yaşamaktadır8. Bu gerçekler, özellikle kronik faz için daha verimli, güvenli ve sahaya uygulanabilir tedavilere izin vermek için T. cruzi’ye karşı yeni ilaçların acilen bulunması gerektiğini vurgulamaktadır. Bu bağlamda, daha etkili bileşiklerin geliştirilmesindeki bir diğer zorluk, in vitro ve in vivo9 ilaç etkinliğini değerlendirmek için sistemlerin sınırlandırılmasıdır.
Kinetoplastid parazitlerde potansiyel ilaç hedeflerinin belirlenmesi için kimyasal biyoloji ve genomik yaklaşımlar kullanılmasına rağmen, T. cruzi’deki mevcut genomik araçlar T. brucei veya Leishmania’nın aksine sınırlıdır. Bu nedenle, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin taranması, ChD’ye karşı yeni kemoterapötik ilaç adaylarının araştırılmasında hala en çok kullanılan yaklaşımdır. genellikle, T. cruzi’deki ilaç keşfi, yeni bir ilacın in vitro testinde epimastigot aşamasına karşı etkilerini test etmekle başlamalıdır. On yıllar boyunca, aday bileşiklerin T. cruzi üzerindeki inhibitör etkilerini ölçmenin tek yolu, zahmetli, zaman alıcı ve operatöre bağımlı olan manuel mikroskobik sayımdı. Dahası, bu yaklaşım az sayıda bileşiğin tahlili için uygundur, ancak büyük bileşik kütüphanelerinin yüksek verimli taranması için kabul edilemez. Günümüzde, birçok araştırma, in vitro olarak test edilen ve parazit büyümesini inhibe etme kapasitelerini test eden farklı kökenlerden çok sayıda bileşiğin analizi ile başlamaktadır. Bu tahlillerde verimi artırmak, taramanın nesnelliğini geliştirmek ve tüm süreci daha az sıkıcı hale getirmek için hem kolorimetrik hem de florometrik yöntemler geliştirilmiştir9.
En yaygın kullanılan kolorimetrik yöntemlerden biri, ilk olarak Bucknet ve işbirlikçileri10 tarafından tanımlanan transfekte parazitlerin β-galaktosidaz aktivitesine dayanmaktadır. Rekombinant parazitler tarafından eksprese edilen β-galaktosidaz enzimi, kromojenik substratı, klorofenol kırmızısını β-D-galaktopiranosid (CPRG), bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak kolorimetrik olarak kolayca ölçülebilen klorofenol kırmızısına hidrolize eder. Böylece, çeşitli bileşiklerin varlığında parazit büyümesi, mikrotitre plakalarında aynı anda değerlendirilebilir ve ölçülebilir. Bu yöntem, epimastigot formlarındaki (böcek vektöründe bulunur), tripomastigotlar ve hücre içi amastigotlar, parazitin memeli evreleri olan ilaçları test etmek için uygulanmıştır. Ayrıca, Escherichia coli β-galaktosidaz enzimini eksprese etmek için pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plazmid (pLacZ)10 ile transfekte edilen birkaç rekombinant T. cruzi suşu zaten mevcuttur (ve yenileri inşa edilebilir), bu da aynı bileşiklere karşı eşit davranmayabilecek farklı ayrık tipleme birimlerinden (DTU’lar) parazitlerin değerlendirilmesine izin verir10,11,12,13 . Bu yöntem, düşük ve yüksek verimli tarama12,13’te T. cruzi’ye karşı aktivite için bileşikleri değerlendirmek için zaten başarıyla kullanılmıştır. Benzer yaklaşımlar, Toxoplasma gondii ve Leishmania mexicana14,15 dahil olmak üzere diğer protozoan parazitlerde de kullanılmıştır.
Bu yazıda, β-galaktosidaz eksprese eden parazitler kullanılarak T. cruzi’nin tüm yaşam döngüsü aşamalarına karşı in vitro ilaç taraması için ayrıntılı bir yöntem açıklanmakta ve gösterilmektedir. Burada sunulan tahliller, DTU I13’ten T. cruzi Dm28c suşunun pLacZ plazmidi (Dm28c/pLacZ) ile transfeksiyonu ile elde edilen β-galaktosidaz eksprese eden T. cruzi hattı ile gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, aynı protokol, bileşikler arasındaki ve T. cruzi suşları veya DTU’lar arasındaki performansı karşılaştırmak için diğer suşlara kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, substrat CPRG varlığında T. cruzi epimastigotların, tripomastigotların veya amastigotlarla enfekte olmuş hücrelerin membran lizisine bağlı olarak salınan sitoplazmik β-galaktosidaz aktivitesinin belirlenmesine dayanan bir test açıklanmaktadır. Buckner ve ortak yazarlar10 tarafından inşa edilen β-galaktosidaz taşıyan plazmid ile transfeksiyondan sonra elde edilen kararlı bir parazit suşu olan T. cruzi Dm28c / pLacZ parazitlerini kullandık. Bu tahl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Buckner’a pLacZ plazmidini nazik bir şekilde sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Arjantin’den Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) ve Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] tarafından desteklenmiştir. Servier Medical Art, Şekil 1’i (https://smart.servier.com) üretmek için kullanılmıştır.
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
References
- Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
- Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
- Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
- Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
- Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
- Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
- Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
- Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
- Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
- Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
- Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
- Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
- García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
- Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
- Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
- Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
- Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
- Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).
