Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese
Summary
Eine verbesserte Plattform für die Kultur ganzer Embryonen ermöglicht eine kontinuierliche und robuste Ex-utero-Entwicklung von Postimplantations-Mausembryonen für bis zu sechs Tage, von den Vorgastrulationsstadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese. In diesem Protokoll beschreiben wir das Standardverfahren für eine erfolgreiche Embryokultur mit statischen Platten und rotierenden Flaschensystemen.
Abstract
Postimplantations-Säugetier-Embryo-Kulturmethoden waren im Allgemeinen ineffizient und auf kurze Zeiträume nach der Dissektion aus der Gebärmutter beschränkt. Vor kurzem wurden Plattformen für eine sehr robuste und verlängerte Ex-utero-Kultur von Mausembryonen von Ei-Zylinder-Stadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese entwickelt. Diese Plattformen ermöglichen eine angemessene und getreue Entwicklung von prägastrulierenden Embryonen (E5.5) bis zur Bildung der hinteren Gliedmaßen (E11). Spätgastrulierende Embryonen (E7.5) werden in diesen Umgebungen in rotierenden Flaschen gezüchtet, während eine erweiterte Kultur aus Vorgastrulationsstadien (E5.5 oder E6.5) eine Kombination aus statischen und rotierenden Flaschenkulturen erfordert. Darüber hinaus sind eine empfindliche Regulierung der O2 – und CO2-Konzentration , des Gasdrucks, des Glukosespiegels und der Verwendung eines spezifischen Ex-utero-Kulturmediums entscheidend für die ordnungsgemäße Embryonalentwicklung. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die erweiterte Ex-utero-Mausembryokultur bereitgestellt. Die Fähigkeit, normale Mausembryonen ex utero von der Gastrulation bis zur Organogenese zu züchten, stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die Wirkung verschiedener experimenteller Störungen während der Embryonalentwicklung zu charakterisieren.
Introduction
Die intrauterine Entwicklung des Säugetierembryos hat die Untersuchung der frühen Stadien der Postimplantationsentwicklung eingeschränkt1,2. Die Unzugänglichkeit des sich entwickelnden Embryos behindert das Verständnis der wichtigsten Entwicklungsprozesse, die nach der Implantation des Embryos in die Gebärmutter ablaufen, wie z.B. die Erstellung des tierischen Körperplans, die Spezifikation der Keimschichten oder die Bildung von Geweben und Organen. Darüber hinaus erschwert die sehr geringe Größe des frühen postimplantierten Embryos die Beobachtung durch intravitale Bildgebung in utero vor E103. Die Unfähigkeit, lebende Embryonen in diesen Stadien zu beobachten und zu manipulieren, hat die Untersuchung der frühen Embryogenese nach der Implantation auf Momentaufnahmen während der Entwicklung beschränkt.
Die Protokolle für die In-vitro-Kultur von Präimplantations-Säugetierembryonen sind gut etabliert, zuverlässig und werden regelmäßig verwendet4. Dennoch hatten Versuche, Ex-utero-Kultursysteme zu etablieren, die in der Lage sind, das richtige Wachstum von Säugetieren nach der Implantation von Embryonen zu unterstützen, nur begrenzten Erfolg5. Seit über einem Jahrhundert wird eine Vielzahl von Kulturtechniken vorgeschlagen, hauptsächlich durch Kultivierung der Embryonen in herkömmlichen statischen Platten6,7,8 oder rotierenden Flaschen (Walzenkulturen)5,9,10. Diese Plattformen erwiesen sich als hilfreich bei der Erweiterung des Wissens über die Entwicklung von Säugetieren nach der Implantation11,12, obwohl sie für das normale Überleben von Embryonen sehr ineffizient und auf kurze Zeiträume beschränkt waren. Die Embryonen zeigten bereits 24-48 h nach Beginn der Kultur Entwicklungsverzögerung und morphologische Anomalien.
Diese Studie liefert eine detaillierte Beschreibung für den Aufbau des Ex-utero-Embryokultursystems , das eine kontinuierliche Entwicklung von der Prägastrulation zu fortgeschrittenen Organogenese-Stadien über bis zu sechs Tage nach der Implantation ermöglicht13. Dieser Artikel beschreibt das verbesserte Walzenkulturprotokoll, das das Wachstum von E7.5-Embryonen (Neuralplatte und Headfold-Stadium) bis zur Hintergliedmaßenbildung (~ E11) und die erweiterte Kultur von E5.5 / E6.5 durch die Kombination von Kultur auf statischen Platten und Rollenkulturplattformen unterstützt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte Kulturprotokoll kann die ordnungsgemäße und kontinuierliche Entwicklung des Mausembryonen ex utero für bis zu sechs Tage von E5.5 bis E11 aufrechterhalten. Zuvor konnten sich Embryonen in diesen Entwicklungsstadien nur für kurze Zeiträume (bis zu 48 h)15 normal in Kultur entwickeln. Die Kopplung des Gasregulationsmoduls an den Rollenkultur-Inkubator zur präzisen Kontrolle der Sauerstoffkonzentration und des hyperbaren Gasdrucks ist entscheidend für die hierin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Pascal und Ilana Mantoux finanziert; Europäischer Forschungsrat (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Professur des Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, das Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella und Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David und Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Nachlass von Zvia Zeroni.
Materials
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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