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생화학

Ensaio de Glicosylase Uracil-DNA por Desorção a Laser Assistida por Matriz/Análise de Espectrometria de Massa

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

Um método não-rótulo, não-isotópico não-radio-isotópico para avaliar a atividade uracil-DNA glicosylase foi desenvolvido usando espectrometria de massa MALDI-TOF para análise direta do produto que contém local apurinic/apyrimidinic. O ensaio provou ser bastante simples, específico, rápido e fácil de usar para a medição de glicosilase de DNA.

Abstract

Uracil-DNA glicosylase (UDG) é um componente-chave na via de reparo de excisão base para a correção de uracil formado a partir de deaminação hidrolítica da citosina. Assim, é crucial para a manutenção da integridade do genoma. Um método altamente específico, não rotulado, não-radio-isotópico foi desenvolvido para medir a atividade udg. Um duplex de DNA sintético contendo um uracil específico do local foi cortado pelo UDG e, em seguida, submetido à análise de espectrometria de massa assistida pela Matrix(MALDI-TOF MS). Um protocolo foi estabelecido para preservar o produto apurinic/apyrimidinic (AP) no DNA sem quebra de fios. A alteração do valor m/z do substrato para o produto foi utilizada para avaliar a hidrólise uracil por UDG. Um substrato G:U foi utilizado para análise cinética UDG que produz o Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. A aplicação deste método a um ensaio inibidor de gllicosylase uracil (UGI) rendeu um valor IC50 de 7,6 pM. A especificidade do UDG usando uracil em várias posições dentro de substratos de DNA de fio único e duplamente encalhados demonstrou diferentes eficiências de decote. Assim, este método simples, rápido e versátil MALDI-TOF MS pode ser um excelente método de referência para várias glicosilases de DNA monofuncionais. Também tem o potencial como ferramenta para a triagem inibidora de glicosilase de DNA.

Introduction

Embora o uracil seja uma base normal no RNA, é uma lesão comum e altamente mutagênica no DNA genômico. Uracil pode surgir de deaminação hidrolítica espontânea/enzimática de uma desoxicytidina. Em cada célula viva, essa desaminação ocorre 100-500 vezes por dia sob condições fisiológicas1,2. Se essas alterações não forem reparadas, pode haver uma mudança na composição da sequência de DNA, causando mutação. Como uracil no DNA prefere emparelhar com dATP durante a replicação, se a citosina desaminar para uracil, em dois eventos de replicação, haverá uma nova mutação de transição G:C para A:T em metade do DNA progêneo3.

Entre as estratégias celulares para manter a estabilidade genética, o reparo da excisão de base (BER) é um mecanismo essencial que repara bases danificadas, como uracil, no DNA4. BER é um processo altamente conservado evolutivamente. Existem duas vias ber gerais: a via de remendo curto que leva a um trecho de reparo de um único nucleotídeo e a via de remendo longo que produz um setor de reparo de pelo menos dois nucleotídeos5. BER é um mecanismo coordenado que ocorre em várias etapas. O primeiro passo no BER é a hidrólise enzimática da base nucleotídea danificada por uma glicosilase de DNA específica para gerar um local intermediário apurinic/apyrimidinic (AP) 6. Isso é seguido pelo decote da espinha dorsal do fosfato de açúcar no local ap por uma endonuclease, a limpeza do DNA termina por uma lise, preenchimento de lacunas por uma polimerase de DNA, e selando o corte final por um ligase5.

Uracil-DNA glicosylase (UDG) hidrolisa o uracil de DNA contendo uracil para BER em Escherichia coli. Ensaios convencionais de UDG utilizando DNA radiolabeled envolvendo diferentes técnicas de separação6,7,8,9,10,11,12,13 são geralmente demorados, intensivos em mão-de-obra, com reagentes de rotulagem dispendiosos, procedimentos complicados e que exigem treinamento intensivo e prática para reduzir riscos de exposição a materiais radioativos. Ensaios de oligonucleotídeos fluorométricos foram desenvolvidos como um substituto para a rotulagem de radioisótopos14, além de faróis moleculares e tecnologia de transferência de energia de ressonância Förster15,16,17,18,19,20. No entanto, é necessária rotulagem específica para todos os métodos acima mencionados. Recentemente foram desenvolvidos ensaios biosensores sem rótulo21,22,23 e métodos colorimétricos baseados na formação de um G-quadruplex24,25,26. No entanto, vários pares A:U ou sequências especialmente projetadas nas sondas complicam a definição da unidade enzimápica.

MALDI-TOF MS é uma tecnologia que pode ser de grande utilidade na análise de DNA. As aplicações desenvolvidas incluem genotipismo de nucleotídeo único genotipagem27,28, análise de nucleotídeos modificados29 e identificação intermediária de reparo de DNA30,31,32,33,34. Maldi-TOF MS deve ser prontamente adotado para análise de glicosylase de DNA para detectar produtos de DNA contendo local de AP. No entanto, os ap-sites no DNA são propensos a quebra de fios em muitas condições experimentais33. Um ensaio UDG é apresentado aqui usando MALDI-TOF MS para medir diretamente a produção do local AP sem ruído significativo de quebra de fios. Este método livre de rótulos é fácil de trabalhar e tem um alto potencial para a aplicação farmacêutica do rastreamento inibidor de glicosylase de DNA.

Protocol

1. Preparação de substrato/modelo Design uracil substrato/modelo duplex com um conteúdo G+C equilibrado de ~50 ± 10% e temperatura mínima de fusão de 50 °C para a região duplex.NOTA: Uma diferença de nucleotídeos entre 18 substratos e 19 modelos nt (Tabela 1 e Figura 1) ajuda a melhor interpretação do sinal de MS e a ressaração adequada. A cadeia de modelo serve como DNA complementar para gerar incompatibilidades A-U ou G-U (<stro…

Representative Results

Modelos e substratosTomando oligonucleotídeos sintéticos com U no centro (U+9) emparelhados com um modelo G como exemplo (Figura 1A), um controle em branco de quantidades equimolares de modelo e substrato contendo uracil pode ser usado para controle de qualidade da pureza oligonucleotídeo sintético (Figura 1B; os sinais correspondem ao m/z designado e ao baixo ruído de fundo). Para a análise dos dados de MS, as alturas máximas foram m…

Discussion

Este artigo fornece um procedimento detalhado para o uso de um método de ensaio UDG MALDI-TOF MS para detectar diretamente produtos de DNA contendo AP. As principais vantagens deste método são que os substratos contendo uracil são livres de rótulos, escaláveis, fáceis de trabalhar e oferecem maior flexibilidade no design de substratos.

A extração de fenol/clorofórmio recomendada pelo fornecedor UDG permite a inativação da enzima para evitar a degradação do DNA do produto. No enta…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Centro Integrado de Genômica Funcional da NCFPB (Taipei, Taiwan) e ao NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [número de subvenção MOST109-2314-B-002 -186 para K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 para S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 para W.-h.F.]. H.-L.C. é um beneficiário de uma bolsa de doutorado da Universidade Nacional de Taiwan. Financiamento para cobrança de acesso aberto: Ministério da Ciência e Tecnologia, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
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References

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Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
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