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생화학

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광법 분석에 의한 우라실-DNA 글리코실라제 분석

Published: April 22, 2022
doi:
10.3791/63089
, , , , , , ,
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine,National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine,National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics,The Ohio State University

Summary

우라실-DNA 글리코실라제 활성을 분석하기 위한 비표지, 비-방사성-동위원소 방법은 직접 아푸린산/아피리미딘 부위 함유 생성물 분석을 위해 MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 개발되었다. 이 분석은 DNA 글리코실라제 측정에 매우 간단하고, 구체적이며, 빠르고, 사용하기 쉬운 것으로 판명되었습니다.

Abstract

우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 시토신의 가수분해 탈아민화로부터 형성된 우라실의 교정을 위한 염기 절제 복구 경로의 핵심 성분이다. 따라서 게놈 무결성 유지에 중요합니다. UDG 활성을 측정하기 위해 매우 특이적이고 라벨링되지 않은 비방사성 동위원소 방법이 개발되었다. 부위 특이적 우라실을 함유하는 합성 DNA 듀플렉스를 UDG에 의해 절단한 다음, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광분석법(MALDI-TOF MS) 분석을 실시하였다. 가닥 파괴 없이 DNA에서 아푸린산/아피리미딘 부위(AP) 생성물을 보존하기 위한 프로토콜이 확립되었다. 기질에서 생성물로의 m/z 값의 변화는 UDG에 의한 우라실 가수분해를 평가하기 위해 사용되었다. UDG 동역학 분석에 G:U 기질을 사용하여 Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s 및 Kcat = 9.31 s-1을 산출하였다. 이 방법을 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 분석법에 적용하면 7.6 pM의 IC50 값이 산출되었다. 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 기질 내의 다양한 위치에서 우라실을 사용한 UDG 특이성은 상이한 절단 효율을 입증하였다. 따라서, 이러한 간단하고, 신속하고, 다재다능한 MALDI-TOF MS 방법은 다양한 단기능 DNA 글리코실라제에 대한 우수한 참조 방법이 될 수 있었다. 또한 DNA 글리코실라제 억제제 스크리닝을 위한 도구로서의 잠재력을 갖는다.

Introduction

우라실은 RNA에서 정상적인 염기이지만, 게놈 DNA에서 흔하고 고도로 돌연변이 유발 병변입니다. 우라실은 데옥시시티딘의 자발적/효소적 가수분해 탈아민화로부터 발생할 수 있다. 각 살아있는 세포에서,이 탈아민화는 생리 학적 조건 하에서 하루에 100-500 번 발생합니다1,2. 이러한 변화가 복구되지 않으면 DNA 서열 조성에 변화가 생겨 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. DNA의 우라실이 복제 중에 dATP와 쌍을 이루는 것을 선호하기 때문에, 시토신이 우라실로 deaminates되면, 두 개의 복제 이벤트에서, 자손 DNA3의 절반에서 새로운 G:C에서 A:T 전이 돌연변이가 있을 것이다.

유전 적 안정성을 유지하기위한 세포 전략 중 염기 절제 복구 (BER)는 DNA4에서 우라실과 같은 손상된 염기를 복구하는 필수 메커니즘입니다. BER은 고도로 진화적으로 보존된 과정이다. 두 개의 일반적인 BER 경로가 있습니다 : 단일 뉴클레오티드의 복구 관으로 이어지는 짧은 패치 경로와 적어도 두 뉴클레오티드의 복구 관을 생성하는 긴 패치 경로5. BER은 여러 단계에서 발생하는 조정된 메커니즘입니다. BER의 첫 번째 단계는 아푸린산/아피리미딘(AP) 중간체 부위6를 생성하기 위해 손상 특이적 DNA 글리코실라제에 의해 손상된 뉴클레오티드 염기를 효소적으로 가수분해하는 것이다. 이것은 엔도뉴클레아제에 의한 AP 부위에서의 당-포스페이트 골격의 절단, 분해효소에 의한 DNA 말단의 정리, DNA 중합효소에 의한 갭-필링, 및 리가아제5에 의해 최종 닉을 밀봉하는 것에 뒤따른다.

우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 대장균에서 BER에 대한 우라실 함유 DNA로부터 우라실을 가수분해한다. 다양한 분리 기술 6,7,8,9,10,11,12,13을 포함하는 방사성 표지 DNA를 사용하는 기존의 UDG 분석은 일반적으로 비용이 많이 드는 라벨링 시약, 복잡한 절차, 방사성 물질에 대한 노출 위험을 줄이기 위해 집중적 인 교육 및 실습이 필요한 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 플루오로메트릭 올리고뉴클레오티드 분석은 분자 비콘 및 Förster 공명 에너지 전달 기술15,16,17,18,19,20 이외에 방사성 동 위원소 표지14의 대체물로서 개발되었다. 그러나, 특정 라벨링은 전술한 모든 방법에 대해 요구된다. 최근 라벨이 없는 바이오센서 분석법21,22,23 및 G-quadruplex24,25,26의 형성에 기초한 비색법이 개발되었다. 그러나 프로브에서 여러 A:U 쌍 또는 특별히 설계된 서열은 효소 단위 정의를 복잡하게 만듭니다.

MALDI-TOF MS는 DNA 분석에 큰 도움이 될 수 있는 기술입니다. 개발된 응용분야에는 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형27,28, 변형된 뉴클레오티드 분석29, 및 DNA 복구 중간체 동정30,31,32,33,34가 포함된다. MALDI-TOF MS는 AP 부위 함유 DNA 생성물을 검출하기 위해 DNA 글리코실라제 분석에 쉽게 채택되어야 한다. 그러나, DNA 내의 AP-부위는 많은 실험 조건 하에서 가닥이 부서지기 쉽다33. UDG 분석은 MALDI-TOF MS를 사용하여 상당한 가닥 파단 잡음 없이 AP 사이트 생산을 직접 측정하기 위해 여기에 제시됩니다. 이 라벨 프리 방법은 작업하기 쉽고 DNA 글리코실라제 억제제 스크리닝의 제약 적용에 대한 높은 잠재력을 가지고 있습니다.

Protocol

1. 기판/템플릿 준비 듀플렉스 영역에 대해 ~50 ± 10%의 균형 잡힌 G+C 함량과 50°C의 최소 용융 온도로 우라실 기판/템플릿 듀플렉스를 설계하십시오.참고: 18 nt 기질과 19 nt 주형(표 1 및 그림 1) 사이의 한 뉴클레오티드 차이는 MS 신호 해석 및 적절한 어닐링을 개선하는 데 도움이 됩니다. 주형 가닥은 A-U 또는 G-U 미스매치를 생성하는 상보적 D…

Representative Results

템플릿 및 기판예를 들어 G 주형과 짝을 이룬 중앙(U+9)에 U를 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 취하면(그림 1A), 등몰량의 주형 및 우라실 함유 기질의 블랭크 조절을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드 순도의 품질 관리를 할 수 있습니다(그림 1B; 신호는 지정된 m/z 및 낮은 배경 잡음과 일치합니다). MS 데이터 분석을 위해, 피크 높이를 ?…

Discussion

이 논문은 UDG MALDI-TOF MS 분석 방법을 사용하여 AP 함유 DNA 생성물을 직접 검출하기 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 방법의 주요 장점은 우라실 함유 기판이 라벨이 없고 확장 가능하며 작업하기 쉽고 기판 설계에 더 큰 유연성을 제공한다는 것입니다.

UDG 공급업체가 권장하는 페놀/클로로포름 추출은 효소의 불활성화를 가능하게 하여 생성물 DNA의 분해를 방지합니다. 그러나 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (대만 타이페이)와 NRPB Pharmacogenomics Lab (대만 타이페이)의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 대만 R.O..C 과학 기술부에서 지원했습니다. [허가 번호 MOST109-2314-B-002 -186 to K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 to S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 to W.-h.F.]. H.-L.C.는 국립 대만 대학에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : 과학 기술부, R.O.C.

Materials

2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2
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References

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Uracil-DNA GlycosylaseMALDI-TOF Mass SpectrometryDNA RepairAP ProductLabel-freeEnzyme Activity AssayGuanine-uracil BaseReaction BufferSubstrate PreparationReaction Termination

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Chang, H., Su, K., Goodman, S. D., Cheng, W., Lin, L., Yang, Y., Chang, S., Fang, W. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).
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